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NT-3 Emax™ ImmunoAssay System

カタログ番号 G7641/G7640

※この説明書は簡易型の日本語マニュアルです。詳細については
Technical Bulletin No.243をご覧ください。

もくじ

  1. サンプル調整
  2. ELISAプレートの作成
  3. スタンダードカーブの調整
  4. ELISAの実施
  5. トラブルシューティング
所要時間 2.5日
必要な試薬
  • carbonate coating buffer
  • TBST wash buffer
  • 1M phosphoric acid

必要な機具/機器
  • 96ウエル平底ELISAプレート
  • plate sealer
  • マイクロプレートリーダー(450nm)
  • (マルチチャンネル)ピペッター
  • ELISA洗浄機(の使用が望ましい)
  • プレート振とう機(の使用が望ましい)
一般的注意事項
  • 本製品は研究用であり、診断用ではありません。
  • スタンダードカーブを外れた値は有効ではありません。
  • 正確な値を出すために、サンプルの希釈にはBlock & Sample 1X Bufferを使用して下さい。
  • 購入後、3ヶ月以内に使用してください。
  • 作成中/後のプレートのウエル表面を傷つけないように十分注意してください。
  • ELISAプレートは正確性を上げるために高品質のものをお使いください。
    [例]Nunc MaxiSorp™(Cat#439454)、Dynatech Immulon
    ®-4(Cat#011-010- 3855)など.
  • 本システムは重炭酸ナトリウムバッファーで最適化しています。他のバッファーの使用は避けてください。
  • 各操作中、ウエルを完全に乾燥させないでください。
  • 抗体を希釈する場合泡立ちを防いでください。
  • ピペッティング、洗浄などの手技の安定性に留意してください。

 

サンプルの調製
  • サンプルの取り扱い

適応するサンプル:組織培養上澄み・血漿・血清・組織溶解液
サンプルを保存する場合は-20℃で凍結し、凍結/融解を繰り返さないで下さい。残さなどは遠心で除いてください。

  • 細胞溶解

下記のlysis bufferで調製できます。

 Lysis bufferの組成
137mM  NaCl 1mM  PMSF
20mM  Tris 10μg/ml  aprotinin
1%  NP40 1μg/ml  leupeptin
10%  glycerol 0.5mM  sodium
 vanadate
  • 酸処理について

酸/中和処理により抽出サンプル(特に脳、血清)中のNT-3検出量が増加することが期待できます。この処理による増感のメカニズムは明らかにされていませんが、レセプターからNT-3が離れるためだと考えられています。しかし、その効果は動物種/組織によっても異なり、場合によってはこの処理が感度を下げることもあるので、前実験でその効果を確認する必要があります。この処理はサンプル中の総NT-3の検出量を上げる方法なので、フリーの成熟NT-3のみの検出には施さないでください。また、キットに添付のNT-3 Standardにも酸処理を行わないでください。

btn_004.gif (574 バイト)酸処理

1)サンプルをDPBS で5倍に希釈

2)希釈サンプル50μlに1N HClを1μl加え、pHが2.0〜3.0であることを確認

3)攪拌し、室温で15〜20分インキュベート

4)1N NaOHを1μl加えpHが約7.5であることを確認

  • 上記のHCl/NaOH添加量は1つの目安で、サンプルの種類により異なります。pHペーパーで確認してください。(血清/血漿の場合は希釈前に1mlあたり1N HClを110-125μl加えます。)
  • サンプル中のキャリアタンパク質が少ない場合、NT-3をロスするおそれがあるので、適量のキャリアタンパク質を含むBlock & Sample 1X Bufferで希釈する必要があります。
  • タンパク質含量が低いサンプルについては直接 酸/中和処理を行ってから、Block & Sample 1X Bufferで希釈することをおすすめします。
  • サンプルは前もって酸処理を行い、-20℃あるいは-70℃で保存することができます。
DPBS(1Lあたり)の組成
0.2g  KCl 1.15g  Na2HPO4
8.0g  NaCl 133mg  CaCl2・2H2O
0.2g  KH2PO4 100mg  MgCl2・6H2O

※1N HCl/1N NaOHでpH7.35に調整

 

ELISA プレートの作成
  • 1日目

I. Anti-NT-3 pAbのコーティング

Anti-NT-3 pAb                     20μl

Carbonate coating buffer   10ml

@液(pAb 溶液/96ウエル分) 10ml 強

Carbonate coting bufferの組成
25mM sodium bicarbonate
25mM sodium carbonate
pH9.7 (1N HCl/1N NaCl)

1)ELISAプレートの各ウエルに@液(pAb 溶液)100μlを添加

2)plate sealerでプレートをシールし、インキュベート4℃、 16-20 時間

  • 2日目

II. Block & Sample 1X buffer調製とウェルのブロッキング

5 X Block & sample buffer           8.6ml
DDW                     34.4ml

A液(1X Block & sample buffer/96ウエル分) 43.0ml

 

1)前日のプレートから余分な@液(pAb溶液)を捨てる

2)TBST wash bufferでウエルを洗浄

3)余分なTBST wash bufferを捨てる

4)プレートの各ウエルにA液200μlを添加

5)インキュベート室温(22-25℃)1時間(振とうしない)

6)余分なA液(Block & sample 1X buffer)を捨てる

7)TBST wash bufferでウエルを洗浄

8)余分なTBST wash bufferを捨てる

9)ELISAプレートの完成

スタンダードカーブ調整

NT-3 スタンダード                           2μl(0.6μg/ml)
Block & sample 1Xbuffer                           3998μl

上記を 混合 (2000倍希釈液) 4000μl(300pg/ml)

2000倍希釈液から2倍希釈系列を作成(300pg/ml〜4.7pg/ml, 0pg/ml)
2つの縦列をスタンダードカーブに使用します。

1)各列のB〜HにウエルあたりBlock & Sample 1X Buffer 100μlを添加

2)各列のAにウエルあたり2000倍希釈液(300pg/ml)200μlを添加

3)各列のAからBに100μl加え、次にBからCに100μl(これをGまで繰り返し、Hには加えない)

ELISAの実施

I. サンプルの添加

テストサンプルは1列ごとに2倍希釈系列を作り、スタンダードカーブから外れにくくすることをおすすめします。サンプル濃度を1ポイント(トリプリケイト)で直接測定し、陽性サンプルについては、正確な濃度を出すために再測定する方法もあります。
注意:サンプルの調製液のみをネガティブコントロールとして測定することをおすすめします。

1)各ウエルに100μlのサンプルを添加(素早く行い、液体の蒸発を防ぐ)

2)Plate sealerでプレートをシールし、6時間、室温で振とう(500±100rpm)しながらインキュベート(振とうを行わないと、感度が落ちることが予想されます。)

3)TBST wash bufferで5回洗浄

II. Anti-HumanNT-3 mAbの添加

Anti-NT-3 mAb                           2μl
Block & Sample 1X Buffer  9.998ml

500倍希釈液(96ウエル分)       10ml

1)上記を各ウエルに100μl添加

2)Plate sealerでプレートをシールし、16-20時間、4℃(振とうしない)でインキュベート

  • 3日目

III. Anti-Mouse IgG HRPの添加

Anti-Mouse IgG HRP                     5μl
Block & Sample 1X Buffer   9.995ml

2000倍希釈液(96ウエル分) 10ml

1)TBST wash bufferで5回プレートを洗浄

2)2000倍希釈液を各ウエルに100μl添加

3)2.5時間、室温で振とう(400±100rpm)しながらインキュベート
※この間に発色用酵素基質の調製を行う。

3)TBSTで5回洗浄

IV. 発色反応

TMB Solution                      5ml
Peroxidase Substrate        5ml

酵素基質液(96ウエル分) 10ml

 

  • 発色反応の約1時間前に調製してください。
  • 遮光して、使用時までに室温にもどしてください。

注意:TMB Solution, Peroxidase Substrate, 1M phosphoric acidは皮膚、目に付けないでください。

1M phosphoric acidの調製
1Lの脱イオン水に67.6mlの85%(14.8M) phosphoric acidを加える。

1)酵素基質液を各ウエルに100μl添加

2)約10分間、室温でインキュベート
※青色を呈してきます。特にスタンダードの発色に留意してください。

3)1M phosphoric acidを100μl添加し、反応を停止
※反応液が酸性になり青色から黄色に変ります。

4)反応停止後1時間以内にプレートリーダーで吸光度(450nm)を測定します。

トラブルシューティング

症状

主な原因

コメント

サンプルの吸光度がスタンダ−ドカ−ブの上限を超えている。 

サンプル中のNT-3が極めて高力価である。 

サンプルを希釈する

希釈系列を変えてスタンダ−ドカ−ブ内に入る様にする。

サンプルの吸光度がスタンダ−ドカ−ブの下限を下回っている。 

サンプル中のNT-3が極めて低力価である。サンプルを希釈し過ぎている。

サンプルの希釈率を下げて再測定する。

すべてのサンプルの吸光度が高い。

バッファーや培地にNT-3が存在している

サンプル調製液(サンプルを含まないバッファーや培地)でネガティブコントロール反応を行う。

すべてのサンプルの吸光度が低い。

発色反応が遅すぎる。または、すぐ止まる。

試薬類の希釈率を再度確認する。

レプリケ−トサンプルで測定値がばらつく。

実験手技の問題

停止液を発色基質液と同じ順番にウエルに添加する。

各試薬添加時にピペットチップを換える。

実験するサンプル数を増やす。

 

ピペットのキャリブレ−ションを行なう。

NT-3スタンダ−ドの失活

スタンダ−ドの保存が不適切。

NT-3スタンダ−ドを希釈せず4℃に保存した場合、購入後3ヶ月安定である。

 

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