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プロメガ製品 Q & A 【 細胞内シグナリング 】

| ADCC Reporter Bioassay Kit |

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ADCC Reporter Bioassay Kit

Q. プロメガのADCC Reporter Bioassayは、どのようにADCC活性を検出しますか?

Q. 従来法との比較データはありますか?

Q. どのような動物種抗体に対応していますか?

Q. ADCC活性を持つ抗体と、持たない抗体を見分けることはできますか?

Q. 抗体の不活化によるADCC活性の変化を見分けることはできますか?

Q. ターゲット細胞の抗原産生量に応じた、ADCC活性の違いを見分けることはできますか?

Q. 1wellあたりの細胞数は?

Q. 各キットの製品構成を教えて下さい。

Q. 初めて使用する場合、どのキットを購入すればよいですか?

Q. G7014, ADCC Reporter Bioassay, Complete Kit (WIL2-S) とG7015, ADCC Reporter Bioassay, Complete Kit (Raji) は何が違いますか?

Q. エフェクター細胞のFcγRIIIa受容体バリアントは何ですか?

Q. ヒトFcγRIV受容体以外のキットはありますか?

Q. キットに付属する細胞を増殖させて使用してもいいですか?

[ 解 答 ]

ADCC Reporter Bioassay Kit

Q. プロメガのADCC Reporter Bioassayは、どのようにADCC活性を検出しますか?

A. 従来の細胞毒性を指標とする方法に代わり、ターゲット細胞に結合した抗体によるエフェクター細胞のNFAT(T細胞核内転写因子)パスウェイを通じた転写活性化をとらえます。ADCC Reporter Bioassayはターゲット細胞の障害は伴いません。

 

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Q. 従来法との比較データはありますか?

A. 従来法(LDH法)との比較を行っています。 下記実験データ(製品マニュアル5ページ Figure. 5)は、抗体のN-グリコシル化の割合に応じたADCC活性について、従来法と相関があることを示しています。

Trastuzumab抗体について、正常なN-グリコシル化された抗体と、脱グリコシル化された抗体の混合サンプルをアッセイに使用した。抗体の脱グリコシル化により、ADCC活性が低下することが知られている。横軸はN-グリコシル化抗体の割合を、縦軸は100% N-グリコシル化抗体の活性値に対する相対値を示す。従来法はCytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assayを使用した。

 

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Q. どのような動物種抗体に対応していますか?

A. ヒト、マウスの各IgGサブタイプに対する反応性は次の通りです。
ヒトIgG1, IgG3 > マウスIgG2a >> ヒトIgG2, IgG4, マウスIgG1
ラット抗体など、ヒト・マウス以外の生物種ではテストしていません。

リツキシマブ (rituximab)のFcドメインを各サブタイプに置換した抗体を使用し、ADCC活性を測定、比較した。ADCC活性のランクは各IgGサブタイプとFcγRIIIa受容体との親和性ランクと一致した。

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Q. ADCC活性を持つ抗体と、持たない抗体を見分けることはできますか?

A. 見分けることができます。
下記データは、ターゲット細胞A431(EGFRを過剰に発現することが知られている)に対する、異なる2種類の抗EGFR抗体のADCC活性を比較しています。ADCC活性のある抗体Cetuximab(anti-EGFR, chimeric IgG1)は濃度依存的に値が上昇するのに対して、ADCC活性の無いPanitumumab(anti-EGFR, human IgG2)の値は上昇しません。

 

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Q. 抗体の不活化によるADCC活性の変化を見分けることはできますか?

A.  見分けることができます。
下記データは、Rituximab抗体の熱不安定化に伴う抗体不活化により、ADCC活性が低下することを示しています。

 

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Q. ターゲット細胞の抗原産生量に応じた、ADCC活性の違いを見分けることはできますか?

A. 見分けることができます。
下記データは、抗原産生量の異なる2つのターゲット細胞(SK-BR-3とSK-OV-3)に対する、抗HER2抗体のADCC活性を比較しています。よりHER2産生量の多いSK-BR-3細胞でADCC活性が高く見られます。

 

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Q. 1wellあたりの細胞数は?

A. ターゲット細胞や抗体、E (Effector) :T (Target) ratioによって変わります。
Complete Kitsのターゲット細胞とコントロール抗体を使うプロトコールでは、E:T=6:1で75,000 cellsのエフェクター細胞を使用します。

 

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Q. 各キットの製品構成を教えて下さい

A. Complete Kit、Core Kit、Target Kitをご用意しています。
Complete Kitはターゲット細胞 (WIL2-SまたはRaji)、エフェクター細胞、コントロール抗体、培地、血清、発光試薬で構成される、ADCC Reporter Assayに必要なすべての試薬、細胞のセットです。
Core KitはComplete Kitからターゲット細胞とコントロール抗体を除いたセットです。Target Kitはターゲット細胞(WIL2-SまたはRaji)とコントロール抗体のセットです。

 

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Q. 初めて使用する場合、どのキットを購入すればよいですか?

A. Complete Kitをご使用ください。
まずComplete Kitでアッセイ系が正常に動くことを確認した後、実験に使用するターゲット細胞でアッセイして下さい。

 

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Q. G7014, ADCC Reporter Bioassay, Complete Kit (WIL2-S) とG7015, ADCC Reporter Bioassay, Complete Kit (Raji) は何が違いますか?

A. ターゲット細胞の細胞株が異なりますが、日本での使用に違いはありません。
どちらもヒトB細胞由来のCD20発現細胞であり、ATCCの規定では両方ともバイオセーフティーレベル(BSL)2と分類されています。
用途と用法が同じWil2-S細胞とRaji細胞の2種類を用意している理由は以下の通りです。 ドイツでは独自規定が使用されており、Raji細胞がバイオセーフティーレベル1、Wil2-S細胞がレベル2と規定されています。
ドイツ国内では実質Wil2-S細胞が使用できないため、Raji細胞のキットを用意しています。

 

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Q. エフェクター細胞のFcγRIIIa受容体バリアントは何ですか?

A. エフェクター細胞は、高親和性のV158バリアント(カタログ番号G7010など)と低親和性F158バリアント(カタログ番号G9790など)の両方をご用意しております。

 

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Q. ヒトFcγRIV受容体以外のキットはありますか?

A. マウスFcγRIV 受容体のキット、およびAntibody Dependent Cellular Phagocytosis(ADCP)活性測定用のヒトFcγRII受容体のキットをカスタム品としてご用意しております。詳細はお問合せ下さい。

 

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Q. キットに付属する細胞を増殖させて使用してもいいですか?

A. エフェクター細胞、ターゲット細胞ともにライセンス上、細胞を増殖させて使用することはできません。
エフェクター細胞については、増殖権のついた細胞株としてプロメガから購入可能です。一度購入すればライセンス料は不要ですが、発光試薬はプロメガ製品を使用する必要があります。
ターゲット細胞を増幅させて使用したい場合は、別途細胞株を入手の上、ご使用ください。プロメガでは販売しておりません。

 

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