プロメガ製品 Q & A 【 アポトーシス 】

 
 

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アポトーシス一般

Q. どのようなアポトーシスの検出システムがプロメガから入手できますか。
Q. アポトーシスとネクローシスはどうやって見分けますか?
Q. アポトーシスにおいて何がイベントの進行を示しますか。またその研究のためにどのようなプロメガ製品が利用できますか?
Q. Caspase-3/7アッセイにはいくつかのキットがあるようですが、どんな違いがありますか?
 

カスパーゼ活性測定

CaspACE™ Assay System, Colorimetric
Q. CaspACE™ Assay System, Colorimetricの実験を行うときに、どのような要因が重要ですか。
 
Apo-ONE Homogenous Caspase-3/7 Assay
Q. カタログ番号G7791とG7781はどこが違いますか?
Q. 細胞内のCaspase-3/7どちらも定量するのですか?
Q. 細胞に試薬を添加後、時間の都合上、翌日にAssay したいと考えていますが、測定値に影響はありますか?
 

TUNEL法

DeadEnd™ TUNEL System
Q. それぞれのシステムにはどのような検出装置が必要ですか。
Q. DeadEnd™ TUNEL SystemにPropidium iodide(PI)は含まれますか?
Q. それぞれのアッセイを使うとき、どのようなコントロール実験を行えばいいですか。
Q. DeadEnd™ Colorimetric Apoptosis Detection Systemを使うときに最適化するのが必要なポイントは何ですか。
Q. これらのシステムではどのような固定剤を使えばいいですか。
Q. 処理をしたサンプルを後で解析するために保存することはできますか。
Q. それぞれのアッセイにかかる時間を教えてください。
 

[ 解 答 ]

 

アポトーシス一般

アポトーシス検出

Q. どのようなアポトーシスの検出システムがプロメガから入手できますか。

A.

 プロメガでは、アポトーシスの指標となるカスパーゼの活性化、あるいはTUNEL(TdT-mediated dUTP Nick End Labeling)法による核DNAの断片化を検出するシステムなど、様々な製品をご用意しています。詳細はアポトーシス関連製品選択ガイドをご参照ください。

アポトーシス関連製品選択ガイドhttp://www.promega.co.jp/cat/1402001.html

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Q. アポトーシスとネクローシスはどうやって見分けますか?

A.

 残念ながら1種類でアポトーシスとネクローシスを見分けることができるマーカーはありません。アポトーシスのマーカーとしてはカスパーゼ活性が、ネクローシスのマーカーとしては細胞膜不完全性がありますが、カスパーゼ活性でネクローシスかどうか判定することは原理的に難しいため、これらを組合せて判定する必要があります。
またアポトーシス初期には細胞増殖停止がみられることも多いため、カスパーゼ活性、細胞膜不完全性と細胞生存性の3つのパラメータを取得することにより詳細な解析が可能となります。図1はパラメータを増やすことにより得られる情報の変化を示したものです。細胞生存性アッセイのみでは「細胞を殺す薬剤」と結論してしまう恐れがありますが、他のパラメータと組み合わせることで正しく細胞の状態を知ることができます。プロメガでは1サンプルからこの3つのパラメータを取得できるApoTox-Glo™ Triplex Assayをご用意しています。

アポトーシス一般

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Q. アポトーシスにおいて何がイベントの進行を示しますか。またその研究のためにどのようなプロメガ製品が利用できますか?

A.

 プログラムされた細胞死に対する興味の高まりは、アポトーシスを検出するための多くの手法の発達をもたらしました。プロメガは、Anti-ACTIVE® Caspase-3 pAb、Anti-PARP p85 Fragment pAb、Caspase™ FITC-VAD-FMK In Situ Marker、DeadEnd™ Fluorometric TUNEL System、DeadEnd™ Colorimetric Apoptosis Detection SystemおよびCaspACE™ Assay Systems, Colorimetricを含む、様々なアポトーシス検出のための抗体や製品を提供しています。これらのシステムのそれぞれの技術的な基礎を簡単に説明し、アポトーシスと関連する特異的な細胞イベントを評価するための各製品の有用性にハイライトをあてました。

アポトーシスは様々な刺激によって引き起こされます。そのような刺激はi) レセプター媒介型 とii)化学物質媒介型の2つの広いグループに分けられます。レセプター媒介型のアポトーシスの典型的な例はFas(CD95/Apo-1)レセプターに結合するFas Ligand(あるいは抗Fas抗体)です。これによりFas レセプターの三量体形成と、FADD/MORT1(Fas-Associated Death Domain)とTRADD(TNF Receptor-Associated Death Domain)のようなレセプターあるいはアダプタータンパク質の細胞内ドメインの移行がもたらされます。それに応じて、これらのアダプターの死作動体ドメイン(DED)はプロカスパーゼ-8のN末端の対応するDED領域と相互に作用します。これによりプロカスパーゼ-8の切断がもたらされ、活性化型のカスパーゼ-8が産生されます。カスパーゼ-8がFas誘因性のアポトーシスのために必要とされることを示している遺伝学的証拠と、それがすべての他の周知のカスパーゼを活性化できるというin vitro の証拠をあわせて、カスパーゼ-8がレセプター媒介型アポトーシスのイニシエーターカスパーゼとして示唆されています(2,3)。活性化型のカスパーゼ-8は、カスパーゼカスケードにおいていわゆる作動体カスパーゼ(例えばカスパーゼ-3と-7)を切断して、活性化します。さらに、活性化型のカスパーゼ-8はBid(プロアポトーシスの Bcl-2ファミリーメンバー)を切断することができ、それにより切断されたBidはミトコンドリアに移送され、続いてチトクロームC(4,5)の放出がもたらされます。放出されたチトクロームCは、dATPの存在下でApaf-1と複合体を形成します。この複合体は移送され、プロカスパーゼ-9を切断して活性化したカスパーゼ-9を産生します(6)。活性化型のカスパーゼ-9は直接作動体カスパーゼを活性化するためにカスパーゼ-8とともに働きます。

化学物質媒介型アポトーシスでは、ミトコンドリアからのチトクロームC放出がカスパーゼ活性化の前に起こります。この放出は、Bidのプロアポトーシスタンパク質Baxとの相互作用のような、Bidの切断とは独立したメカニズムに起因すると考えられます(7)。チトクロームCの放出に続いて、レセプター媒介型アポトーシスで上に記述されているのと同じような方法で、カスパーゼ-9が活性化されます。

両方の例で、後期のアポトーシスイベントは作動体カスパーゼの活性化の後に起きます。これらのイベントには細胞膜外部表面におけるホスファチジルセリンの露出(Annexin V結合)、Poly(ADP-ribose)Polymerase(PARP)の切断および染色体DNAの断片化が含まれます。

プロメガではアポトーシスの初期と後期両方の研究のために複数の製品を揃えています。CaspACE™ Assay System, Colorimetric(カタログ番号G7351、G7220)は、アポトーシス細胞におけるカスパーゼ-1あるいはカスパーゼ-3の活性を測定するために使用されます。さらに、新製品のAnti-ACTIVE® Caspase-3 pAb(カタログ番号G7481)は、アポトーシス細胞で活性化型のカスパーゼ-3を免疫細胞化学により検出するために使用できます。直接アポトーシス細胞をラベルするためには、CaspACE™ FITC-VAD-FMK In Situ Marker(カタログ番号G7461、G7462)を使うことができます。この製品はパン-カスパーゼ阻害剤VAD-FMKの細胞透過性のフルオレセインイソチオシアネート(FITC)結合体で、不可逆的に活性化型カスパーゼに結合するため、アポトーシス細胞をin situで特異的に標識できます。同様に、細胞透過性のパン-カスパーゼ阻害剤、Caspase Inhibitor Z-VAD-FMK(カタログ番号G7231、G7232)は、アポトーシスにおけるカスパーゼ依存性経路とカスパーゼ非依存性経路を研究するためにすぐご利用いただけます。

チトクロームC局在の研究のために、プロメガはチトクロームCに対してのネズミモノクローナル抗体、Anti-Cytochrome C mAb(カタログ番号G7421)を提供します。一般に、ミトコンドリア特異的ダイ(例えばCMX-rosamine)を使った二重染色法が行われます。非アポトーシス細胞で、チトクロームC標識は斑点状のCMX-Rosamine の染色を反映する染色となるはずです。アポトーシス細胞では、チトクロームCは放出されているため、染色のこの同局在性は見られなくなります。チトクロームCは細胞質中に放出されると不安定になるため、多くの場合まったく染色が確認されない可能性があります。したがって、使われた染色条件がどんな存在するチトクロームCでも検出することが可能であることを示すために、非アポトーシスのコントロールを使うことが重要です。

アポトーシス後期の研究のために、PARPのp85カスパーゼ分解産物をプロメガのAnti-PARP p85 Fragment pAb*(カタログ番号G7341)を使って同定することができます。この製品は免疫細胞化学染色用にデザインされていて、PARPの切断型を特異的に識別します。この抗体はインタクトな完全長のPARPタンパク質を認識しません。したがって、この抗体で陽性に染色された細胞はアポトーシスを起こしていることを示しています。最後に、プロメガではアポトーシスの顕著な特徴とされるDNAの断片化を調べる2つのTUNEL法キットも提供しています。DeadEnd™ Fluorometric TUNEL System(カタログ番号G3250)は、断片化DNAの3'-OH末端にフルオレセイン-12-dUTP*を加えるためにターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(Tdt)を使います。この標識は蛍光顕微鏡あるいはFluorescent Activiated Cell Sorting(FACS™)分析を使って視覚化されます。比色定量法のアッセイの方を希望する研究者のために、DeadEnd™ Colorimetric Apoptosis Detection System(カタログ番号 G7130、G7360)では、断片化されたDNAの3'-OH末端をビオチン化されたヌクレオチドでラベルします。ビオチン化された断片はその後ストレプトアビジン- HRP結合体と沈殿性のHRP基質(DABと過酸化水素)により検出できます。アポトーシスを起こしている核は標準的な光学顕微鏡下で視覚化され、茶色に見えます。

CellTiter 96R AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(カタログ番号G3580、カタログ番号G3581、カタログ番号G3582)は、テトラゾリウム化合物MTSを着色されたホルマザン産物に還元する細胞の能力を測ることによって、細胞生存度についてのin vitro の情報を提供します。活発な細胞代謝により、テトラゾリウム還元に必要なNADHのような還元物質の生成がもたらされます。着色されたホルマザン産物へのMTSの変換の増加は、生存する細胞数の相対的な指標となり、減少は細胞死の相対的な指標となります。

最近、カスパーゼ-8の1番目の死作動体ドメイン(DED)がそのカスパーゼ活性に依存せずにc-Jun N-terminal kinase(JNK)経路を活性化することができること、そして同じくこのような活性化を阻止するこのドメインにおける突然変異がFasレセプターによって媒介されるアポトーシスを阻止するということが明らかにされました(8)。したがって、JNK はアポトーシスにおいても何らかの役割を演じている可能性があります。JNK経路の分析のために、プロメガはAnti-ACTIVE® JNK pAb, Rabbit (カタログ番号V7931とV7932)を提供します。この抗体はウェスタン分析と免疫細胞染色の両方で使うことができます。 (eNotes - FAQ)

関連リンク
http://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/apoptosis/#title2

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Q. Caspase-3/7アッセイにはいくつかのキットがあるようですが、どんな違いがありますか?

A.

 Caspase-3/7アッセイには検出方法の違いにより、3種類のアッセイシステムがあります。発色検出(405nmでモニタリング)のCaspACE™ Assay System, Colorimetric、蛍光検出(rhodamine 110、励起波長498nm、最大蛍光波長521nm)のApo-ONE™ Homogeneous Caspase-3/7 Assay、発光検出のCaspase-Glo™ 3/7 Assayの3システムになります。検出感度は、発色<蛍光<発光の順番で高くなり、発色検出のCaspACE™ Assay System, Colorimetricでは、アッセイには少なくとも1X10E+6個の細胞が必要です。またアッセイ方法は、発色検出のCaspACE™ Assay System, Colorimetric ではCell Lysateを調製する必要がありますが、蛍光検出のApo-ONE™ Homogeneous Caspase-3/7 Assay、発光検出のCaspase-Glo™ 3/7 AssayではCell-Based Assayが可能です。各アッセイキットの感度・レンジデータは「こちら」をご参照ください。なおCaspase-Glo™ 3/7 Assayは、他の蛍光アッセイシステムとマルチアッセイを行うことも可能です。ApoTox-Glo™ Triplex Assayなどのマルチアッセイシステムも用意しています。

マルチアッセイガイド
http://www.promega.co.jp/multiassay.html

 

カスパーゼ活性測定

 

CaspACE™ Assay System, Colorimetric

Q.  CaspACE™ Assay System, Colorimetricの実験を行うときに、どのような要因が重要ですか。

A.

 キットに添付のCell Lysis Buffer(細胞溶解剤)で107~108 cells/mlに当たる濃度で目的の細胞を溶解することを推奨します。溶解液のタンパク質濃度の測定には、界面活性剤により影響されないタンパク質試験(たとえばBio-Rad DC Protein Assay; Bio-Rad: Cat.# 500-0116またはPierce BCA Protein Assay; Thermo Scientific: Cat.# 23225)を推奨します。反応は25~100ugのタンパク質総量を含む溶解液を96ウェル形式で行います。溶解しにくい細胞があるため、それぞれの系で完全に溶解する(もっとも強いシグナルを与える)ために必要とされる凍結/融解の回数を決定する必要があります。

一般的に、アポトーシスを誘導すると予想される因子の濃度を上げながら目的の細胞に加え、それを最長24時間までインキュベートします。アポトーシスが起こっている時、caspase-3活性はコントロールのバックグラウンドとして捕らえられる無処理細胞のDEVDase活性の少なくとも2倍を示します。また、誘導した細胞にZ-VAD-FMK阻害剤を加えた場合、DEVDase活性は未処理のコントロール細胞と同等またはそれ以下のレベルに下がります。コントロールと誘導した細胞の間で顕著な変化が確認されなかった場合、またZ-VAD-FMK阻害剤の添加によって反応が阻害されない場合、テストされたレベルでの誘導因子ではDEVDase依存的なアポトーシスが起こっていないことを示します。

caspase-3誘導の経時的な観察はアポトーシスの時間的な事象の変化を決定するために必要です。また、細胞の操作が顕著なcaspase-3活性化をバックグラウンドとして引き起こしているかどうか決定するために必要です。すべてのアッセイは同時に停止することが重要です。そのため経時的なアッセイは、一番時間の長いサンプルから短いものへと開始していき、同時に終わるようにします。(PN72-Q&A)

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Apo-ONE Homogenous Caspase-3/7 Assay

Q.  カタログ番号G7791とG7781はどこが違いますか?

A.

 G7781内の試薬は、Bufferのみです(注*2)。G7791はBufferと基質が製品に含まれています。
(注*2: BufferでApo-ONEの基質を希釈することによって、Assayの条件を最適化することができます。)

 

Q.  細胞内のCaspase-3/7どちらも定量するのですか?

A.

 Apo-ONE Homogenous Caspase-3/7 Assayは、Caspase-3およびCaspase-7に共通のDEVDase活性によって、その基質であるZ-DEVD-R110のR110(蛍光)の放出を測定します。そのためCaspase-3/7どちらも定量することができます。

 

Q.  細胞に試薬を添加後、時間の都合上、翌日にAssay したいと考えていますが、測定値に影響はありますか?

A.

 Incubate後、-70℃で保存してください。サンプルは融解後に測定しても測定値に影響はありません。

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TUNEL法

DeadEnd™ TUNEL System

Q. それぞれのシステムにはどのような検出装置が必要ですか。

A.

 DeadEnd™ Fluorometric TUNEL Systemを使ってラベルされた接着細胞や組織切片の解析には蛍光顕微鏡が必要です。サンプルは、Fluoresceinの緑色の蛍光を見るために520±20nmで標準のFluoresceinのフィルターを使って解析します。Propidium iodideの赤色の蛍光は620nm以上で見ることができます。FluoresceinとPropidium iodideを同時検出できる広域透過性のフィルターを用いると両方で染められた細胞は黄色に見えます。

DeadEnd™ Fluorometric TUNEL Systemを使ってラベルされた浮遊性の細胞の検出には、フロー・サイトメーターを用います。蛍光顕微鏡と同じように、Fluoresceinは、520±20nmで検出され、Propidium iodideは620nm以上で検出されます。

DeadEnd™ Colorimetric TUNEL Systemを使って処理されたサンプルの解析には、光学顕微鏡が必要です。ラベルされたアポトーシスを起こした核は濃い茶色に見えます。

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Q. DeadEnd™ TUNEL SystemにPropidium iodide(PI)は含まれますか?

A.

 含まれません。別途ご購入ください。

 

Q. それぞれのアッセイを使うとき、どのようなコントロール実験を行えばいいですか。

A.

 それぞれのアポトーシス検出システムについて陽性コントロールと陰性コントロールの両方を実施することを薦めます。これらのコントロールには、アッセイ中の成分に対する陽性および陰性コントロールや、生物学的な陽性コントロールが含まれます。固定した細胞や組織切片をDeadEnd™ Fluorometric TUNEL SystemまたはDeadEnd™ Colorimetric TUNEL Systemを使って染色する前にDNase Iで処理すると、TdT(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase)によってエンドラベルされる多くの断片を生じるので、ラベリングの陽性コントロールとして適しています。ラベリングの反応液中にTdTが加えられていない、陰性コントロールも実施する必要があります。これらのコントロールにより、Fluorescein-dUTPまたはビオチン化したヌクレオチドの非特異的な結合の測定ができます。

またDeadEnd™ Fluorometric TUNEL System、DeadEnd™ Colorimetric TUNEL SystemおよびCaspACE™ Assay Systemでは、生物学的な陽性コントロールを使うことを薦めます。アポトーシスが起こっていることが報告されている生物学的システムには、camptothecinやanisomycinによるHL-60細胞の処理(1-5)、PC12細胞におけるNGFの欠乏(6)、マウスの胸腺の白血球におけるグルココルチコイドにより誘導されるアポトーシス(7,8)、あるいはFas受容体またはTNF受容体を持つ細胞のそれぞれのリガンドによる活性化(9)などがあります。

参考文献
  1. Del Bino, G. et al. (1991) Exp. Cell Res. 195, 485.
  2. Li, X. et al. (1995) Cytometry 20, 172.
  3. Gorczyca, W. et al. (1993) Cancer Res. 53, 3186.
  4. Darzynkiewicz, Z. et al. (1992) Cytometry 13, 795.
  5. Polverino, A.J. and Patterson, S.D. (1997) J. Biol. Chem. 272, 7013.
  6. Batistatou, A. and Greene, L.A. (1991) J. Cell Biol. 115, 461.
  7. Gavrieli, Y. et al. (1992) J. Cell Biol. 119, 493.
  8. Cohen, J.J. and Duke, R.C. (1984) J. Immunol. 132, 38.
  9. Tewari, M. and Dixit, V.M. (1995) J. Biol. Chem. 270, 3255.

 

Q. DeadEnd™ Colorimetric Apoptosis Detection Systemを使うときに最適化するのが必要なポイントは何ですか。

A.

 DeadEnd™ Systemを使ってアポトーシスを解析する時にキーとなる要因は細胞や組織を浸透化するための方法です。チャンバースライドやpoly-L-lysineでコートしたスライドの上で培養された細胞では、10% buffered formalinや4% paraformaldehydeの迅速な固定化に続く、0.2% Triton X-100の浸透化が一般的に適当です。しかし組織ではより厳密な方法が要求されます。DeadEnd™ Systemは、組織の浸透化のためにProteinase Kを添付しています。組織の切片は、20μg/ml Proteinase Kで10~30分間室温で処理します。一般的に薄い切片(例えば5~10umのパラフィン切片)では短いインキュベーション時間で十分です。一方、厚い切片(例えば50μmのビブラトーム切片)では長い時間が必要となります。しかし、長時間のインキュベーションによってスライドから組織切片がはがれる可能性があります。

アポトーシスの誘導物質や実験の条件を設定するための予備実験では、陽性コントロール実験が必須です。陽性コントロールを準備するために、細胞や組織切片を浸透化した後、DNaseIをスライドに加えます。断片化されたゲノムDNAは、TdTによってラベルされます。この陽性コントロールのプロトコールはDeadEnd™ Systemに添付される取扱説明書(Technical Bulletin)に記載されています(1)。標準的な試験で、アポトーシスを誘導すると推定される因子で処理した細胞が標識されず、陽性コントロールが陽性だった(標識された)場合、キット自体は正しく機能しており、全ての予測される可能性において、テストされている因子はこれらの条件下でDNAの断片化を誘導していないことになります(を示しています)。(PN72-Q&A)

参考文献
  1. DeadEnd™ Colorimetric Apoptosis Detection System Technical Bulletin #TB199, Promega Corporation.

 

Q. これらのシステムではどのような固定剤を使えばいいですか。

A.

 DeadEnd™ Fluorometric TUNEL SystemおよびDeadEnd™ Colorimetric TUNEL Systemでは、もっとも標準的な固定剤(例えば1-4% methanol-free formaldehyde、 4% paraformaldehyde、 4% paraformaldehyde/ 0.5% glutaraldehydeおよび10% buffered formalinなど)を使うことができます。スライドに固定した細胞は、PBSまたはTBS中で4℃で1~2週間、または70%エタノール中で-20℃で保存できます。組織サンプルは、ホルマリン固定またはパラフィン切片にします。エタノールやメタノールでの固定は薦めません。

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Q. 処理をしたサンプルを後で解析するために保存することはできますか。

A.

 DeadEnd™ Fluorometric TUNEL Systemでラベルした細胞または組織切片は、ラベリング反応が終了した後すぐに蛍光顕微鏡で解析します。時間をおいて解析する場合はanti-fade solutionを使います。別の方法として、Fluoresceinでラベルされたスライドを4℃暗所で数日間保存することができます。フローサイトメトリーで解析するための処理をした浮遊細胞は、解析するまで4℃暗所で保存し、染色後4~6時間以内に解析します。
DeadEnd™ Colorimetric TUNEL Systemを使って処理されたサンプルは、かなり安定なので、4℃で数週間保存できます。しかし、ラベルしたスライドを長期間保存する場合は、-20℃での保存を薦めます。

 

Q. それぞれのアッセイにかかる時間を教えてください。

A.

 蛍光顕微鏡とDeadEnd™ Fluorometric TUNEL Systemを使ってアポトーシスによって断片化されたDNAを検出するためには、終了までに約3~5時間必要です。フローサイトメーターを使う場合は、終了までに約5~9時間かかります。しかし、このフローサイトメトリーのプロトコルには、氷上で5分間の0.2% Triton R X-100の処理に代えられる4時間の70%エタノール浸透の手順が含まれ、測定にかかる時間をかなり減らすことができます。
DeadEnd™ Colorimetric TUNEL Systemを使う、アポトーシスにより断片化されたDNAの検出のためのプロトコルでは、終了までに4~6時間を要します。細胞や組織抽出液、あるいはタンパク質のフラクション準備後のCaseACE™ Assay Systemによるアッセイにかかる時間は約2~3時間です。

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