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プロメガ製品 Q & A 【 BacTiter-Glo™ Microbial Cell Viability Assay 】

 


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Q. BacTiter-Glo™とは、どのような試薬ですか?

Q. BacTiter-Glo™の保存条件と保存期間はどれぐらいですか?

Q. BacTiter-Glo™の測定機器や測定容器にはどのようなものがお薦めですか?

Q. BacTiter-Glo™はどのような細菌に使うことができますか?

Q. BacTiter-Glo™はどのような培地で使うことができますか?

Q. BacTiter-Glo™の発光シグナルの安定性は、細菌種や培地によって変わりますか?

Q. BacTiter-Glo™は何個の細菌から測定することが可能でしょうか?

Q. 有機溶媒の添加により、BacTiter-Glo™の発光は影響を受けることがありますか?

Q. BacTiter-Glo™は培養液のpHの影響を受けますか?

Q. BacTiter-Glo™で真菌の測定は可能でしょうか?

Q. 死菌に由来するATPを測定することはありませんか?

Q. 細菌が多数存在するにもかかわらず、バックグラウンドと同程度の発光量しか得られません。どのような理由が考えられますか?

 

BacTiter-Glo™ Microbial Cell Viability Assay

Q.BacTiter-Glo™とは、どのような試薬ですか?

BacTiter-Glo™ Luminescent Cell Viability Assayは、内在性のATPをルシフェラーゼ反応に用い、発光量を定量することで、生存する(代謝活性のある)細菌数を測定する試薬です。BacTiter-Glo™により得られる発光シグナルは、存在するATP量に比例し、培地中の細菌数を反映します。BacTiter-Glo™はシンプルなホモジニアスアッセイ(添加-混和-測定)試薬であり、発光シグナルの半減期は通常30分以上です。

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Q.BacTiter-Glo™の保存条件と保存期間はどれぐらいですか?

表1をご覧ください。

表1 試薬の保存期間

未開封時の品質保証期間 試薬調製後の保存温度、保存期間および試薬の活性
-20℃, 6ヶ月 4℃, 4日間 : 活性は20%低下
-20℃, 1週間 : 活性は20%低下
-70℃, 1ヶ月 : 活性は20%低下

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Q.BacTiter-Glo™の測定機器や測定容器にはどのようなものがお薦めですか?

発光の測定にはルミノメーターが必要になります。プロメガではシングルチューブおよび96ウエル、384ウェルプレート対応の各種ルミノメーターを取り扱っています。これらのルミノメーターの違いは、”ルミノメーター&フルオロメーター選択ガイドをご覧ください。
発光を測定するときに推奨する96ウエルプレートは、”ルミノメーターQ&A - どのような96ウエルプレートを使うことができますか?” をご覧ください。

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Q.BacTiter-Glo™はどのような細菌に使うことができますか?

プロメガでは、表2で示した細菌種で試験済みです。これら以外の細菌種でも、細菌溶解が可能であれば、BacTiter-Glo™を使うことができます。その際は、段階希釈した培養液をサンプルとし、細菌数と発光量の相関性を調べることにより、目的の細菌種が溶解されているかをご確認ください。

表2. BacTiter-Gloで試験済みの細菌種

表2 BacTiter-Gloで試験済みの細菌種

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Q.BacTiter-Glo™はどのような培地で使うことができますか?

プロメガでは、Mueller Hinton、L-Broth、Trypticase Soy Broth、YPDで試験済みです。細菌種によっては生育条件が特殊なため、BacTiter-Glo™アッセイに適さない培地を使用することもありえます。その際には、Mueller Hintonに培地を交換してご利用ください。

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Q.BacTiter-Glo™の発光シグナルの安定性は、細菌種や培地によって変わりますか?

細菌種(図1)や培地(図2)を変更することで、シグナルの安定性に大きな差は見られません。しかし、新規の細菌種や培地を使用する際には、それらを試料とした場合の発光シグナルの安定時間をあらかじめご検討ください。

図1 細菌種によるBacTiter-Gloの発光シグナルの安定性

図1. 細菌種によるBacTiter-Glo™の発光シグナルの安定性
約106個の図中に示したそれぞれの細菌を含むMueller Hinton II BrothにBacTiter-Glo™を加え、経時的に発光量を測定した。

図2 培地の種類によるBacTiter-Gloの発光シグナルの安定性

図2. 培地の種類によるBacTiter-Glo™の発光シグナルの安定性
大腸菌を含む図中に示したそれぞれの培地にBacTiter-Glo™を加え、経時的に発光量を測定した。

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Q.BacTiter-Glo™は何個の細菌から測定することが可能でしょうか?

大腸菌 40個、黄色ブドウ球菌 150個、緑膿菌 70個、セレウス菌 10個からの測定が可能です(図3)。

図3 BacTiter-Gloの発光量と細菌数の相関性

図3. BacTiter-Glo™の発光量と細菌数の相関性
Mueller Hinton II培地で培養した細菌を50倍希釈した。さらに数時間の培養により得られた対数増殖期の細菌のみを連続段階希釈して、サンプルとした。細菌数はLB寒天培地におけるCFUとしてカウントした。

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Q.有機溶媒の添加により、BacTiter-Glo™の発光は影響を受けることがありますか?

最終濃度3%以下のDMSO、イソプロパノール、エタノール、メタノールの混入は、BacTiter-Glo™の発光に影響を与えないことを確認しています(図4)。

図4 BacTiter-Gloに対する有機溶媒の影響

図4. BacTiter-Glo™に対する有機溶媒の影響
約1×10-12 molesのATPを含むMH II培地にそれぞれの有機溶媒を最終濃度0%または3%となるように加え、BacTiter-Glo™の発光量を測定した。

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Q.BacTiter-Glo™は培養液のpHの影響を受けますか?

BacTiter-Glo™は強いバッファー成分を含んでいるため、酸性やアルカリ性の培養液にもご使用いただけます。

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Q.BacTiter-Glo™で真菌の測定は可能でしょうか?

Candida albicans、Saccharomyces cerevisiaeでの実績があります。Candida albicansは厚い細胞壁により構成されているため、溶菌に15分以上のインキュベーション時間を設定する必要があります。

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Q.死菌に由来するATPを測定することはありませんか?

死菌から放出されたATPは迅速に分解されてしまうため、BacTiter-Glo™で検出されることはありません。

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Q.細菌が多数存在するにもかかわらず、バックグラウンドと同程度の発光量しか得られません。どのような理由が考えられますか?

  • 静止期の細菌は代謝活性が低く、内在性のATP量は非常に低いと考えられます。対数増殖期の細菌をサンプルとしてご利用ください。
  • 次のような理由により、細菌が十分に破壊されていないことが考えられます。
    A) 細胞壁が非常に強固である⇒インキュベーション時間を延長してください。
    B) 細菌数が過剰に含まれている⇒適正な細菌数に調整してください。
  • 培地にルシフェラーゼ反応を阻害する物質が含まれていることが考えられます。他の培地や添加物の影響をご検討ください。

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