HOME > テクニカルサービス > Q & A もくじ > 細胞増殖&毒性試験

プロメガ製品 Q & A 【 細胞増殖&毒性試験 】

 
| CellTiter-Blue(蛍光検出) | CellTiter96(発色検出)シリーズ |
細胞増殖テスト
 

[ メニュー ]

 

CellTiter-Blue(蛍光検出)

Q. リファレンス波長(注*1)のとり方を教えてください。
Q. 試薬の保存温度および保存期間は?
 
 

CellTiter96(発色検出)シリーズ

Q. CellTiter 96®シリーズ細胞増殖試験キットとはどのようなキットですか?
Q. CellTiter 96®シリーズ細胞増殖試験キットはどのように機能しいているのですか?
Q. CellTiter 96®とCellTiter 96® AQueous細胞増殖試験キットはどのように異なるのですか?
Q. CellTiter 96® AQueous One Solution 細胞増殖試験キットは、CellTiter 96® AQueous 細胞増殖試験キットとどのように異なりますか?
Q. どのようにCellTiter96®シリーズは機能しますか。それぞれのバージョンはどのように違いますか
Q. CellTiter 96®シリーズ細胞増殖試験キットで変換されるホルマザン産物の吸光度を測定するために使う波長は?リファレンス波長を使うべきですか?
Q. CellTiter 96®シリーズ細胞増殖試験キットは[3H]-チミジン取り込み試験とどう違いますか?
Q. CellTiter 96®シリーズ細胞増殖試験キットは、[3H]-チミジン取り込み試験に比べてどのような利点がありますか?
Q. CellTiter 96®シリーズ細胞増殖試験キットを使うとどの細胞種を試験できますか?特別な考慮を必要とする細胞はありますか?
Q. CellTiter 96®シリーズ細胞増殖試験キットを使って十分な読み値を得るには、どれぐらいの細胞が必要ですか?
Q. 一般的なバックグラウンドの吸光度レベルはどれぐらいですか?どのような要因がバックグラウンドに寄与しますか?どのようにバックグラウンドは補正されるのですか?
 

[ 解 答 ]

 

 CellTiter-Blue(蛍光検出)

Q. リファレンス波長(注*1)のとり方を教えてください。

A. 発色で吸光度を測定する場合は、570nmの各サンプルの値から600nmの培地のみの値を引いてください。(注*1: 分光光度計で測定する場合、サンプルの吸光度(Resorufinのピーク570nm)から培地のみの吸光度(Resazurinのピーク605nm)を差し引く必要があります。) (TB317)

メニューQ&Aもくじ日本語ホーム
 

Q. 試薬の保存温度および保存期間は?

A. 遮光保存 -20℃で12ヶ月、または4℃で6-8週間になります(10回まで凍結融解できます)。(TB317)

メニューQ&Aもくじ日本語ホーム
 

 CellTiter96(発色検出)シリーズ

Q. CellTiter 96®、CellTiter 96® AQueousおよびCellTiter 96® AQueous One Solution細胞増殖試験キットとはどのようなキットですか?

A. CellTiter 96®、CellTiter 96®AQueousおよびCellTiter 96®AQueous One Solution細胞増殖試験キットは、細胞増殖試験において生細胞数を測定するために、[3H]‐チミジン取込み試験に代わる迅速・簡便な‐RIの手法です。これらのキットは、細胞増殖試験に加えて細胞接着 [Klemke, R.L. et al. (1994) J. Cell. Biol. 127, 859.]、細胞毒性[Cappling, B.G. et al. (1988) Leukemia Res. 12, 823.]、アポトーシス試験[Wong, G.H.W., and Goeddel, D.V. (1994) J. Immunol. 152, 1751.]に適用することができます。(FAQ-Tech)

メニューQ&Aもくじ日本語ホーム
 

Q. CellTiter 96®、CellTiter 96®AQueousおよびCellTiter 96®AQueous One Solution 細胞増殖試験キットはどのように機能しいているのですか?

A. これらの試験は、細胞によるテトラゾリウム塩(CellTiter 96®AssayではMTT、CellTiter 96®AQueous AssayおよびCellTiter 96® AQueous One Solutionでは MTS を利用)のホルマザン産物への変換に基づいています。ホルマザン産物は、標準的な ELISA プレートリーダーで測定できる特異的な波長を吸収します。ほとんどの実験系では、吸光度が培養液中の生細胞数に直接比例します。(FAQ-Tech)

メニューQ&Aもくじ日本語ホーム
 

Q. CellTiter 96®とCellTiter 96® AQueous細胞増殖試験キットはどのように異なるのですか?

A. CellTiter 96®とCellTiter 96® AQueous 細胞増殖試験キットは共に、生細胞によるテトラゾリウム化合物からホルマザン産物への変換量を測定します。これらのキット間の主な違いは、
CellTiter 96® AQueous (CellTiter 96® AQueous One Solutionも同様に細胞増殖試験キットではテトラゾリウム試薬としてMTTではなくMTSを利用している点です。アッセイ中に、MTSは可溶性のホルマザン産物に変換されるため、MTT法を基にしたCellTiter 96®キットのように有機性のSolubilization Solutionの添加による可溶化を必要としません。したがって、CellTiter 96® AQueousまたはCellTiter 96®AQueous One Solutionキットを使って試験したサンプルはそのまま測定することができます。また必要ならば、インキュベーターに戻すことで、さらに発色を促進したり、経時的な研究を行うことができます。(FAQ-Tech)

メニューQ&Aもくじ日本語ホーム
 

Q. CellTiter 96® AQueousOne Solution 細胞増殖試験キットは、CellTiter 96® AQueous 細胞増殖試験キットとどのように異なりますか?

A. CellTiter 96® AQueous One Solution細胞増殖試験キットでは、テトラゾリウム塩(MTS)と電子輸送試薬(PES)を単一の安定な溶液として組み合わせています。一方、CellTiter 96® AQueous細胞増殖試験キットでは、MTSとPMS(PESとは異なります)を別々に包装していますCellTiter 96®AQueous One Solution細胞増殖試験キットの簡便な"1溶液(One Solution)"包装が、従来のCellTiter 96® AQueous 細胞増殖試験キットからの主な改良点です。(FAQ-Tech)

メニューQ&Aもくじ日本語ホーム
 

Q. どのようにCellTiter96® は機能しますか。それぞれのバージョンはどのように違いますか?

A. CellTiter96® Assayは、生理活性のある細胞によるテトラゾリウム塩(MTTまたはMTS)の安定なフォルマザン産物への還元を基本としています。フォルマザン産物は特定の波長の光を吸収するため、標準的なELISAプレートリーダーで定量することができます。ほとんどの系において吸収は培養液中の生細胞数と比例します。CellTiter96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (カタログ番号 G4000、G4001)は、MTTを含むDye Solution、界面活性剤と有機溶媒を含むSolubilization/Stop Solutionからなります。Solubilization/Stop Solutionは、細胞により還元されたフォルマザン産物の結晶を溶解するために使います。CellTiter96® AQueous Cell Proliferation Assay (カタログ番号 G5421、G5430、G5440)では、テトラゾリウム試薬としてMTTの代りにMTSを使います。MTSは、有機溶媒の添加が不必要な可溶性のフォルマザン産物に変換されます。そのため、CellTiter96® AQueous Assay Systemを使って調整されたサンプルは、測定後、さらに発色させたい時にインキュベーターに戻して反応を進めることができます。CellTiter96® AQueous Assay SystemはMTSとPMS(phenazine methosulfate;電子捕獲剤)を別々のボトルに入れています。CellTiter96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (カタログ番号 G3580、G3581、G3582)では、簡便性を考え、一本のボトルに安定な溶液としてMTSとPES(phenazine ethosulfate;電子捕獲剤)を混合して入れています。

CellTiter96®、CellTiter96® AQueous、CellTiter96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assayの3種類は[3H]チミジン取り込み試験に対するNon-RIの代用手法として使われます。CellTiter96® Assayでは、細胞をまきなおしたり培地を交換する必要がないため、より多くの実験手順を必要とする(結果的に誤差が広がることになる)[3H]チミジン取り込み試験と比べ、標準偏差が小さくなります。

[3H]チミジンの取り込みと生産されるフォルマザン産物の量を、異なるサンプル間の成長因子の量の測定試験で比較したとき、違いは5%以下でした。[3H]チミジンの取り込みの結果は一般的にcounts per minutes (cpm)で表されます。一方、CellTiter96® Cell Proliferation AssayはMTTでは570-630nm、MTSでは490nmで測定する吸光度で表されます。哺乳類(浮遊細胞、付着細胞)、植物、酵母の培養細胞を含むほとんどの真核生物で十分に吸光度を変化させるだけの産物を作ります。より低い代謝比率を有するいくつかの細胞種では、十分な吸収度を得るために、通常より多くの細胞数を必要とします(5~25倍の細胞数)。CellTiter96®は細菌、菌類、原生動物にも使うことができます。

MTS法を基にしたCellTiter96® AQueous One Solution Systemは試薬を“加え”、測定する”だけの96ウェルタイプの試験でもっとも便利な方法です。バックグラウンドの吸光度をかなり下げたい、またはデータを測定する前にプレートを長期間保存しなければならないような状況では、MTT法を基にしたCellTiter96® Systemをおすすめします。(PN70-FAQ)

メニューQ&Aもくじ日本語ホーム
 

Q. CellTiter 96®、CellTiter 96® AQueous、および CellTiter 96® AQueous One Solution細胞増殖試験キットで変換されるホルマザン産物の吸光度を測定するために使う波長は?リファレンス波長を使うべきですか?

A. CellTiter 96®細胞増殖試験においてMTTが還元されたホルマザン産物は、570nmで吸光度ピークを示します。しかし、550~600nmの間のどの波長でもデータを記録することができます。
CellTiter 96® AQueousおよびCellTiter 96® AQueous One Solution細胞増殖試験においてMTSが還元されたホルマザン産物は490nmで吸光度ピークを示します。しかし、450~540nmの間のどの波長でもデータを記録することができます。

リファレンス波長の使用は、細胞残さ、指紋やその他の非特異的な吸光に起因するバックグラウンドを減少させます。リファレンス波長には630~750nmの間が使われます。しかし、より優れた感度を得るには650nm以上のリファレンス波長を使います。お手持ちのプレートリーダーが2波長を設定できない場合、リファレンス波長を使用しなくても同種のサンプル間におけるデータの正確さには最少の影響しか与えません。(FAQ-Tech)

メニューQ&Aもくじ日本語ホーム
 

Q. CellTiter 96®、CellTiter 96® AQueous、CellTiter 96® AQueous One Solution細胞増殖試験キットは[3H]-チミジン取り込み試験とどう違いますか?

A. CellTiter 96®、CellTiter 96® AQueous、およびCellTiter 96® AQueous One Solution 細胞増殖試験キットでは細胞の回収や培地の交換が不要なため、より多くの細胞を扱う操作が必要なことから誤差を生じやすい[3H]-チミジン取り込み試験と比べ、より低い標準偏差の値が得られます。[3H]-チミジンの取り込みと変換されたホルマザン産物量の直接的な比較では、数種類のサンプルにおいて成長因子の濃度を検定した場合、これらの試験系の間で5%以下の差しか示されませんでした [Riss, T. (1991) Promega Notes 32, 1., Buttke, T.M. et al. (1993) J. Immunol. Methods 157, 233.]。現在、[3H]- チミジン取り込み試験を採用している場合、RI標識したチミジンを添加する時点で、かわりにCellTiter 96® SystemのDye Solutionを添加して代用できます。(FAQ-Tech)

メニューQ&Aもくじ日本語ホーム
 

Q. CellTiter 96®、CellTiter 96® AQueous、およびCellTiter 96® AQueous One Solution細胞増殖試験キットは、[3H]-チミジン取り込み試験に比べてどのような利点がありますか?

A. 以下のように多くの利点が挙げられます。(FAQ-Tech)
 ・放射性同位元素を使いません。
 ・実際に作業を行う時間が短い。
 ・迅速に結果が得られます。
 ・細胞の回収と洗浄が不要です。
 ・ELISAプレートリーダーを使って96ウェルプレートを簡便に測定できます。
 ・付着細胞でも浮遊細胞でも同じ手順にしたがって試験できます。

メニューQ&Aもくじ日本語ホーム
 

Q. CellTiter 96®、CellTiter 96® AQueous、CellTiter 96® AQueous One Solution細胞増殖試験キットを使うとどの細胞種を試験できますか? 特別な考慮を必要とする細胞はありますか?

A. 哺乳類(付着細胞と浮遊細胞)、植物および酵母を含む培養中のほとんどの真核細胞においてDyeは十分に還元されます。代謝活性の低いいくつかの細胞種(たとえば血液の白血球)では、十分な吸光度の読み値を得るために通常よりも多くの細胞数(ウェルあたり5~25倍)が必要です。さらに、このキットは細菌[Stevens, M.G. and Olsen, S.C. (1993) J. Immunol. Methods 157, 225.]、菌類[Mikami, Y. et al. (1994) Mycoses 37, 27.]、原生動物 [Dungan, C.F. and Hamilton, R.M. (1995) J. Euk. Microbiol. 42, 379.]にも使えます。(FAQ-Tech)

メニューQ&Aもくじ日本語ホーム
 

Q. CellTiter 96®、CellTiter 96® AQueous、CellTiter 96® AQueous One Solution細胞増殖試験キットを使って十分な読み値を得るには、どれぐらいの細胞が必要ですか?

A. ほとんどの腫瘍細胞、ハイブリドーマ、繊維芽細胞では、増殖試験を1ウェルあたり5,000個の細胞から始めることを推奨します。しかし、通常では1,000個以下の細胞でも検出できます。
例外として血液の白血球が知られており、十分な読み値を得るには一般的に1ウェルあたり25,000-250,000個の細胞が必要です。(FAQ-Tech)

メニューQ&Aもくじ日本語ホーム
 

Q. 一般的なバックグラウンドの吸光度レベルはどれぐらいですか?どのような要因がバックグラウンドに寄与しますか?どのようにバックグラウンドは補正されるのですか?

A. たとえウェルに細胞が入っていなくても、バックグラウンドの吸光度が通常観察されます。
培地のpHの増加や還元剤の存在と同じく、使っている培地や血清のタイプが、バックグラウンドの吸光度レベルに寄与します。この吸光度は一般的に4時間のインキュべーション後では0.2-0.4ユニットを示し、適切なコントロールのウェルにより補正されます。バックグラウンドの測定には、実験用のウェルと同様に培地と試薬を含むが、細胞は含まないウェルを3セット準備してください。
これらの”細胞を含まない”コントロールウェルから得られた吸光度の平均値を、その他のすべてのウェルで得られた吸光度から引いて吸光度の補正を行います。(FAQ-Tech)

メニューQ&Aもくじ日本語ホーム