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プロメガ製品 Q & A 【 アポトーシス アッセイ 】

| Caspase-Glo™ Assay |

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Caspase-Glo™ Assay

Q. Caspase-Glo™ Assayとはどのような製品ですか?

Q. 蛍光法(Apo-ONE® Homogenious Caspase-3/7 Assay, G7792)と比較してどのような利点がありますか?

Q. 試薬の保存期間はどれくらいですか?

Q. Caspas-Glo™は、接着細胞に使用できますか?

Q. アポトーシスが誘導されていない細胞(Background)で測定値が高くなってしまいました。どのような原因が考えられますか?

Q. Caspase-Glo™ Assay 試薬は、培地に直接添加できるようになっていますが、サンプルの細胞を細胞溶解剤で溶解後にアッセイすることはできますか?

Q. Caspase-Glo™を用いて、Caspase-3/7, 8, 9の活性測定を行いました。その結果、Caspase-3/7の活性は、シグナルとして認められましたが、Caspase-8または-9のシグナルは認められませんでした。この原因には何が考えられますか?

Q. 組織サンプルを用いてCaspaseを測定することはできますか?

Q. Caspaseの活性を細胞数で補正したいと考えていますが、同じサンプルを用いてCaspaseの活性測定と細胞数の測定をすることはできますか?

Q. Caspase-3/7とCaspase-8または Caspase-9の活性を、同時に測定することはできますか?

[ 解 答 ]

Caspase-Glo™ Assay

Q. Caspase-Glo™ Assayとはどのような製品ですか?

A. Caspase-Glo™は、アポトーシス誘導に伴うCaspase ( 3/7, 8, 9) の活性を測定する製品です。
薬剤等で処理した培養細胞にCaspaseTM-Glo試薬を添加すると、細胞が溶解し、Caspase認識配列のルシフェリンからの切断反応とLuciferase反応が連続的に生じます(図1)。Caspaseの活性は、Luciferase反応による発光量(RLU値)で示されます。Caspaseの活性が高いと、RLU値は大きくなります。逆にCaspaseの活性が低いと、RLU値は小さくなります。

図1 Caspase-Glo Assayの反応機構

注)測定は、ルミノメーター(発光測定装置)を使用します。

 

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Q. 蛍光法(Apo-ONE® Homogenious Caspase-3/7 Assay, G7792)と比較してどのような利点がありますか?

A. 蛍光法では、テスト化合物や基質の間で見られる励起光や蛍光の交錯が、分析結果に影響を与えることがあります。さらに、高いS/N比を得るためには、分析時間を長く設定する必要があります。一方、Caspase-Glo™ Assayを用いたアッセイでは、発光法による検出のため、そのような化合物の干渉を受けることはありません。また、短時間に高いS/N比を得ることができ、しかも、高感度アッセイのため、少量のCaspase活性も十分に測定することができます。 Caspase-Glo™ Assayと蛍光法を使用してCaspaseの活性を測定したデータを以下の図2および図3に示します。

図2 Apo-ONE®(蛍光法)とCaspase-Glo™ (発光法)を用いたCaspase-3/7活性測定の比較(Jurkat Cells)

図3 蛍光法とCaspase-Glo™8および9 Assay(発光法)のシグナル比較データ

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Q. 試薬の保存期間はどれくらいですか?

A. 表1に示すとおりになります。

表1  試薬の保存期間

製品名 未開封時の
品質保証期間
試薬調製後の保存温度、
保存期間および試薬の活性
凍結融解
Caspase-Glo™ 3/7 Assay -20℃、6ヶ月間 4℃、3日間:活性変化なし
4℃、1週間:活性は10%低下
4℃、4週間:活性は25%低下
-20℃、4週間:活性は40%低下

10回まで
Caspase-Glo™ 8 Assay -20℃、6ヶ月間 4℃、1週間:活性は5%低下
10回まで
Caspase-Glo™ 9 Assay -20℃、6ヶ月間 4℃、1週間:活性は5%低下 (注1) (注2)

(注1):4℃の条件下で6ヶ月間保存した場合、活性はほとんど見られませんでした(DTTの劣化が原因と考えられます)。
(注2):溶かした試薬はその日に使い切り、凍結融解をしないようにしてください(-20℃での保存の場合、小分けにして保存してください)。

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Q. Caspas-Glo™は、接着細胞に使用できますか?

A. 接着細胞でも使用可能です。

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Q. アポトーシスが誘導されていない細胞(Background)で測定値が高くなってしまいました。どのような原因が考えられますか?

A. Caspase-Glo™Assayは感度の高い製品ですので、少ない細胞数でもCaspaseを検出することができます。アポトーシスが誘導されていない細胞で測定値が高くなってしまう要因は、以下の2点について考えられます。

1) wellあたりに含まれる細胞数が多く、コンフルエントな状態になっている
2) 培地成分にLuciferaseの反応に影響する物質が含まれている

このような場合は、刺激を加えていない細胞(Background)とアポトーシスを確実に誘導できる物質で処理した細胞(Positive control;実験系は表2をご参照ください)で確認いただいてから、測定・比較をしてください(図4)。

図4 Jurkat cells をanti-Fas mAb で 4.5 時間処理し、アポトーシスを誘導させました。その後、Caspase-Glo™ 3/7試薬を添加し、1時間後にルミノメーターで測定しました。 96 well plateでの反応容量は200μLです(うち、Caspase-Glo™試薬は100μL添加)。

表2 アポトーシス誘導の条件

Caspase 細胞種 アポトーシス誘導物質 濃度(終濃度) 誘導時間
Caspase-3/7
Jurkat (10,000 cells/well) Anti-Fas 抗体 100-200ng/mL 4-5 時間
Caspase-3/7
Staurosporine 500-1000nM 4-5時間
Caspase-3/7
HeLa (10,000 cells/well) Staurosporine 1000nM 5 時間
Caspase-3/7
MCF-7 (25,000 cells/well) Staurosporine 5μM 5 時間
Caspase-3/7
Rat Primary Striatal Neural Culture(25,000 cells/well) Staurosporine 3-5μM 5 時間
Caspase-3/7
HepG2 variant (40,000 cells/well) Staurosporine 500-1000nM 24 時間
Caspase-3/7
PC 12 (10,000-20,000 cells /well) Staurosporine 10μM 5時間~10時間
Caspase-8
Jurkat (10,000-50,000 cells /well) Anti-Fas 抗体 100 ng/mL 3時間
Caspase-9
HL-60 (10,000-50,000 cells /well) Vinblastine 50μM 3時間
Caspase-8, 9
HeLa (25,000 cells /well) Staurosporine 50μM 0~5時間処理し、30分間隔でアッセイを行った結果、2.5時間 から活性が検出され、4.5時間で最大活性が認められます。

 

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Q. Caspase-Glo™ Assay 試薬は、培地に直接添加できるようになっていますが、サンプルの細胞を細胞溶解剤で溶解後にアッセイすることはできますか?

A. 可能です。その際は以下の方法に従ってください。

①基質を溶解していないCaspase-Glo™ Assay Bufferで細胞を溶解する
②基質の濃度を2倍に調製した2xCaspase-Glo 試薬を添加する

なお、プロメガから販売されている他の細胞溶解剤の利用に関しましては、テクニカルサービス部までお問い合わせください。

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Q. Caspase-Glo™を用いて、Caspase-3/7, 8, 9の活性測定を行いました。その結果、Caspase-3/7の活性は、シグナルとして認められましたが、Caspase-8または-9のシグナルは認められませんでした。この原因には何が考えられますか?

A. 測定のタイミングに留意してください。活性型Caspase-8またはCaspase-9は、Caspase-3/7よりも早い時期に誘導され、Caspase3/7によって分解されてしまいます。従って、Caspase-8またはCaspase-9を検出するためには、Caspase-3/7の活性が認められるよりも早い時期に測定することが必要です。 また、Caspase活性の検出が認められない場合は、プロメガで確認している条件 または、Apoptosis Assistant で得られる誘導条件でCaspase活性を確認してください。

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Q. 組織サンプルを用いてCaspaseを測定することはできますか?

A. プロメガでは、Caspase-Glo™を用いて組織に存在するCaspase活性は確認しておりません。ただし、文献(1)でマウスの肝臓をホモジネートしたのち、Caspase-Glo™を用いてCaspase-3/7, 8, 9を測定した報告例があります。この論文の手順は以下のとおりになります。

1) マウスの組織を低浸透性buffer(25 mM HEPES, pH 7.5, 5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 1 mM Pefablock, 1 μg/mL, pepstatin, leupeptin, aprotinin)でホモジネートする
2) 13,000rpm、4 ℃、15分間遠心
3) タンパク濃度を1mg/mLとなるように調整する
4) 10μg/mLの細胞質タンパクと同じ容量のCaspase-Glo™試薬を96 well plateに加え、室温で1時間インキュベート
5) ルミノメーターで発光値を測定

参考文献(1):
Liu, D, Li, C, Chen, Y, Burnett, C, Liu, XY, Downs, S, Collins, RD, and Hawiger, J.Nuclear Import of Proinflammatory Transcription Factors Is Required for Massive Liver Apoptosis Induced by Bacterial Lipopolysaccharide. Journal of Biological Chemistry 279, (46) pp. 48434-48442, 2004

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Q. Caspaseの活性を細胞数で補正したいと考えていますが、同じサンプルを用いてCaspaseの活性測定と細胞数の測定をすることはできますか?

A. 細胞数測定にCellTiter-Blue™ Cell Viability Assay (カタログ番号, G8080) 、Caspaseの活性測定にCaspase-Glo™ 3/7 Assayを使用したマルチアッセイを行うことができます。ただし、この方法では(Caspaseを)単独で測定した場合と比較して、シグナル強度は低下します。細胞種によっては、アポトーシスを誘導したサンプルでこのマルチアッセイが行えない場合があります。プロトコルについては、こちらをご参照ください。
(CELL NOTES ISSUE, 10, 2004, 15-18: http://www.promega.com/cnotes/cn010/cn010_15.pdf

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Q. Caspase-3/7とCaspase-8または Caspase-9の活性を、同時に測定することはできますか?

A. Apo-ONE® Homogeneous Caspase- 3/7 Assay (カタログ番号, G7792) とCaspase-Glo 8 Assay またはCaspase-Glo 9 Assayを使用してアッセイすることができます。ただし、この組み合わせでマルチアッセイを行った場合、シグナル強度が低下し、アポトーシスを誘導したサンプルで活性を検出することが難しくなることがあります。以下のURLに記載されている方法をご参照ください。
(CELL NOTES ISSUE, 10, 2004, 15-18: http://www.promega.com/cnotes/cn010/cn010_15.pdf

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