HOME > テクニカルサービス > Q & A もくじ > CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay

プロメガ製品 Q & A 【 CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay 】

 

[メニュー]

Q. CellTiter-Glo® とは、どのような試薬ですか?

Q. CellTiter-Glo® の保存条件と保存期間はどれぐらいですか?

Q. CellTiter-Glo® の測定機器や測定容器にはどのようなものがお薦めですか?

Q. CellTiter-Glo® と他のプロメガの細胞増殖試験キットとの違いを教えてください。

Q. CellTiter-Glo® アッセイに影響を与える要因としてどのようなものが挙げられますか?

Q. 細胞溶解剤で処理を行った細胞ライセートをCellTiter-Glo® のサンプルとして使うことはできますか?

Q. 測定後の試料をタンパク定量に使うことはできますか?

Q. 試験化合物の添加により細胞が増えなくなりました。増殖阻害と細胞傷害の両面を検討したいのですが、ひとつのサンプルで両方を検討することはできますか?

Q. 細菌数の測定にも利用できますか?

Q. CellTiter-Glo® 2.0、CellTiter-Glo® 3Dは従来のCellTiter-Glo® と何が異なりますか?

 

CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay

CellTiter-Glo® とは、どのような試薬ですか?

CellTiter-Glo® は、細胞の内在性のATPを定量することで、生存する細胞数を測定する試薬です。CellTiter-Glo® は、細胞溶解成分と発光試薬成分から構成されています。

  • “添加→撹拌→測定”だけのホモジニアスアッセイのキットです。
  • 試薬の添加後、10分で結果が得られます。
  • 96ウエルプレートでは約50個の細胞から検出できる高感度です。
  • 発光シグナルの半減時間は5時間程度です。

メニューQ&Aもくじ日本語ホーム

 

CellTiter-Glo® の保存条件と保存期間はどれぐらいですか?

表1をご参照ください。

表1. 試薬の保存期間

未開封時の品質保証期間 試薬調製後の保存温度、
保存期間および試薬の活性
凍結融解と試薬の活性
-20℃, 6ヶ月 -20℃, 21週間 : ほぼ活性は維持される
4℃, 2日間 : 活性は5%低下
4℃, 4日間 : 活性は15%低下
室温, 2日間 : 活性は25%低下
室温, 4日間 : 活性は50%低下
5回 : 活性は3-5%低下
10回 : 活性は5-10%低下

メニューQ&Aもくじ日本語ホーム

 

CellTiter-Glo® の測定機器や測定容器にはどのようなものがお薦めですか?

発光の測定にはルミノメーターが必要になります。プロメガでは 96ウエルプレート対応ルミノメーター を取り扱っています。
発光を測定するときに推奨するプレートは表2をご覧ください。
測定には、以下の2つの方法を取ることができます。

  1. クリアボトムプレート(底面は無色透明、壁面は白色不透明)で培養と測定の両方を実施する。
  2. 培養プレート(全面が無色透明)で培養し、CellTiter-Glo® を添加し、細胞を溶解した後に、全量をソリッドプレート(全面が白色不透明)のプレートに移して測定する。

注) 一般的にCellTiter-Glo® をご利用する場合にはサンプル数が多いため、シングルチューブ対応のルミノメーターはお薦めいたしません。

表2. ルミノメーター推奨プレート

メーカー タイプ 型番 特徴
コーニング・コースター ソリッドプレート 3912 白色 / 平底 / 滅菌未処理
/ フタなし / 表面処理なし
クリアボトムプレート 3610 白色 / 平底 / 滅菌処理済み
/ フタあり / 細胞培養表面処理
ナルジェ・ヌンク ソリッドプレート
(ルミヌンクプレート)
136101 白色 / 平底 / 滅菌処理済み
/ フタあり / 細胞培養表面処理
クリアボトムプレート
(オプチィカルボトムプレート)
165306 白色 / 平底 / 滅菌処理済み
/ フタあり / 細胞培養表面処理
パーキンエルマー ソリッドプレート
(OptiPlate-96)
6005290 白色 / 平底 / 滅菌未処理
/ フタなし / 表面処理なし
クリアボトムプレート
(ViewPlate-96)
6005181 白色 / 平底 / 滅菌処理済み
/ フタあり / 細胞培養表面処理

参考資料:

1. Thompson, J.F. et al. (1991) Gene 103, 171.
2. Bronstein, I. et al. (1994) Anal, Biochem. 219, 169
3. Luciferase Assay System Technical Bulletin #TB101, Promega Corporation.
4. Matthews, J.C. et al. (1977) Biochemistry 16, 85
5. Lorenz, W.W. et al. (1993) In : Bioluminescence and Chemiluminescence John Wiley and Sons, 191.
6. Alam, J. and Cook, J.L. (1990) Anal. Biochem. 188, 245
7. Shaw, V.W. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4438.
8. Lorenz, W.W. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4438

メニューQ&Aもくじ日本語ホーム

 

CellTiter-Glo® と他のプロメガの細胞増殖試験キットとの違いを教えてください。

CellTiter-Glo® と他のプロメガの細胞増殖試験キットとの比較は表3をご覧ください。CellTiter-Glo® は、約50個から50,000個の細胞数を測定することができます。しかし、細胞の種類や細胞の状態により含まれるATPの量は異なります。また、測定機器であるルミノメーターの感度にも依存しますので、あらかじめ適切な細胞数の検討をお薦めします。

表3. CellTiter-Glo® と他の細胞増殖試験キットとの比較

  CellTiter-Glo® Assay CellTiter-Blue™ Assay CellTiter 96®
AQueous One
Solution Assay
No-RI
検出 発光 蛍光(Ex560nm/Em590nm)
発色(570nm)
発色 (490nm)
感度 ◎(50cells) ◎ (100~500 cells) ◎ (1,000 cells)
試薬添加後の
インキュベーション時間
約10分間 1~4時間 1~4時間
ワンステップ
シグナルの安定性 5時間以上 24時間以内* 18時間以内**
原理 生細胞由来のATPを、ルシフェラーゼ反応により生じる発光として測定 各種還元酵素によるレサズリンの還元により生成するレゾルフィンの蛍光および発色として測定 NAD/NADHによるPMSを介したMTSの還元により生じるホルマザン産物を測定

*蛍光検出の場合

**停止液を添加した場合

メニューQ&Aもくじ日本語ホーム

 

* FBS = fetal bovine serum; HS = horse serum

メニューQ&Aもくじ日本語ホーム

 

CellTiter-Glo® アッセイに影響を与える要因としてどのようなものが挙げられますか?

1) 温度
CellTiter-Glo® はルシフェラーゼ反応を利用していますので、温度は重要な要因になります。アッセイの前にCellTiter-Glo® Reagentと培養プレートを必ず室温に戻してください。
バッファー成分を含まない培地を使っている場合、CO2インキュベーターから取り出したプレートの培地は、pHが上がる可能性があります。このような場合には、インキュベーターから取り出した直後にCellTiter-Glo® Reagentを加え、その後、十分に室温に戻ってから発光値を測定してください。

2) 培地の種類
プロメガでは、DMEM、F12、F12/DME、MEM、RPMI 1640を使用しています。DMEM、F12、F12/DME、MEMでは発光量に差がありませんでしたが、RPMI 1640は製造元やロットの違いにより差を生じることがあります。

3) 有機溶媒
有機溶媒の添加により、若干の影響を示す可能性があります(表5)。ご利用の細胞において、あらかじめ有機溶媒の影響をご確認ください。

表5. 有機溶媒と発光量の関係

有機溶媒の終濃度 発光量の増減
0.5-4.0% DMSO 5-20%の発光量が増加
0.5-4.0% ジメチルホルムアミド ほとんど影響なし
0.5-2.0% アセトニトリ ほとんど影響なし
1.0-5.0% エタノール ほとんど影響なし
7.5% エタノール 15%の発光量が低下

4) 血清
プロメガでは、仔ウシ(calf)血清、ウシ胎児(fetal bovine)血清、ウマ(hourse)血清を含むさまざまな培地(DMEM、F12、F12/DME、MEM、RPMI 1640)でCellTiter-Glo® Reagentの発光量を調べました。その結果を図1にご紹介します。

図1 発光量における血清の影響

図1. 発光量における血清の影響
2μM ATPを含む50μl RPMI 1640に、20%の図中に示した血清を含む培地を加えた(血清の終濃度は10%)。100μlのCellTiter-Glo? Reagentを加え、発光量を測定した。コントロールには、1μM ATPを含む100μl DPBSを使った。

5) フェノールレッド
フェノールレッドを加えた培地を利用することは、CellTiter-Glo® アッセイにほとんど影響しないと考えられます。

(参考) 10.6mg/mLのフェノールレッドを加えたときに、10%以下の発光量の低下が確認されています。

メニューQ&Aもくじ日本語ホーム

 

細胞溶解剤で処理を行った細胞ライセートをCellTiter-Glo® のサンプルとして使うことはできますか?

細胞ライセート中のATPは迅速に分解されるため、細胞ライセートをサンプルとすることはお薦めできません。

(参考) CHO-K1 cellsを界面活性剤で処理し、処理後90分間、経時的にCellTiter-Glo® Reagentを加え、発光量を測定したところ、ATP量は急激に減少し、12分後にはもとの80%のATPが分解されていました。さらに、約1時間後にはバックグランド程度のATPしか残っていませんでした。

メニューQ&Aもくじ日本語ホーム

 

測定後の試料をタンパク定量に使うことはできますか?

D.W.で100倍希釈すれば、BCA Protein Assayの試料として使うことができます。詳細はこちらをご覧ください。

メニューQ&Aもくじ日本語ホーム

 

試験化合物の添加により細胞が増えなくなりました。増殖阻害と細胞傷害の両面を検討したいのですが、ひとつのサンプルで両方を検討することはできますか?

可能です。細胞上清をサンプルとしてCytoTox-ONE™ Homogeneous Membrane Integrity Assay (カタログ番号 G7891)により細胞毒性試験を実施し、細胞をサンプルとしてCellTiter-Glo® で細胞増殖試験を実施することができます。
詳細はPrometech Journal No16をご覧ください。

メニューQ&Aもくじ日本語ホーム

 

細菌数の測定にも利用できますか?

細胞壁の溶解が困難なため、推奨することはできません。細菌数の測定には、BacTiter-Glo® Microbial Cell Viability Assay (カタログ番号G8230)をお薦めします。

メニューQ&Aもくじ日本語ホーム

 

CellTiter-Glo® 2.0、CellTiter-Glo® 3Dは従来のCellTiter-Glo® と何が異なりますか?

従来のCellTiter-Glo® と比べ、基質とバッファーがあらかじめ混合されておりますので、試薬調製が不要です。その他、試薬安定性、発光半減期、アプリケーションが異なります。詳細は下図をご参照ください。

CellTiter-Glo<sup>®</sup> 2.0、CellTiter-Glo<sup>®</sup> 3D、CellTiter-Glo<sup>®</sup> の違い

メニューQ&Aもくじ日本語ホーム