プロメガ製品 Q & A 【 細胞毒性試験 】

CytoTox-ONE™ (蛍光検出) | CytoTox 96® (発色検出)

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Q. プロメガで取り扱いのある細胞毒性試験の製品を教えてください。

CytoTox-ONE™ (蛍光検出)

Q. CytoTox-ONE™ とはどのような製品ですか?

Q. CytoTox-ONE™ の測定原理を教えてください。

Q. CytoTox-ONE™ の測定に適したプレートを教えてください。

Q. CytoTox-ONE™ の保存条件を教えてください。

Q. CytoTox-ONE™ の使用方法を教えてください。

Q. CytoTox-ONE™ を使用して最大LDH放出量はどのように測定しますか?

Q. CytoTox-ONE™ のアッセイに影響を及ぼす要因には何がありますか?

Q. CytoTox-ONE™ を使用する際に、細胞数について留意することはありますか?

Q. 添加する.試験物質に関して留意することはありますか?

Q. フルオロメーターに560nm と 590nmのフィルターセットがない場合はどうすればよいでしょうか?

Q. 毒性試験CytoTox-ONE™と増殖試験CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay(以下CellTiter-Glo®)もしくはCellTiter Blue™ Cell Viability Assay(以下CellTiter Blue™)で測定した結果において、IC50 値(50%の阻害が起きる濃度)の相関性はありますか?

Q. プロメガのCytoTox-ONE™とCellTiter-Blue™はどちらもレサズリンを使用しますが、どのような原理の違いがありますか?

Q. CytoTox-ONE™とプロメガの他のアッセイを同じサンプルを用いて測定するマルチアッセイは可能ですか?

Q. CytoTox-ONE™ の使用実績を教えてください。

CytoTox 96® (発色検出)

Q. CytoTox 96®はどのような製品ですか?

Q. CytoTox 96®の試薬の保存条件と保存期間はどれぐらいですか?

Q. CytoTox 96®51Cr放出試験の結果の相関性はありますか?

Q. CytoTox 96® の使用方法を教えてください。

Q. CytoTox 96®のバックグラウンドの吸光値に影響を与える要因には何がありますか?

Q. 細胞種によって最適なターゲット細胞数は異なりますか?

Q. 添加する試験物質に関して留意することはありますか?

Q. プレートリーダーを490nmに設定できない場合、どうすればよいでしょうか?

Q. Lysis Solution (10X)の組成を教えてください。

Q. Positive control のLDH濃度(uni™ L)を教えてください。

Q. CytoTox 96®アッセイを行ったプレートを保管し、後で測定することができますか?

Q. 後日に解析するためにサンプルを保管できますか?

Q. 標的細胞から自然に放出されるLDHの値を少なくするための注意点はありますか?

Q. CytoTox 96®の使用実績を教えてください。

[ 解 答 ]

Q. プロメガで取り扱いのある細胞毒性試験の製品を教えてください。

A. 細胞から放出されるLDHを蛍光検出するCytoTox-ONE™ Homogeneous Membrane Integrity Assay(以下CytoTox-ONE™ 、カタログ番号G7890)と LDHを発色検出するCytoTox 96®Non-Radioactive Cytotoxicity Assay(以下CytoTox 96® 、カタログ番号G1780)があります。 製品の違いについては、以下の表にまとめました。

表 CytoTox-ONE™ とCytoTox 96®の比較

  CytoTox-ONE™ CytoTox96®
アッセイ方法

この試薬は生細胞にほとんどダメージを与えないので、細胞を培養したプレートに直接添加できます。試薬添加後、10分間インキュベーションして蛍光測定します。

標準的なアッセイでは、細胞培養上清を測定用プレート移し、試薬を添加します。30分間のインキュベーションの後、発色測定します。
シングル
インジェクション
○* ×
測定装置 フルオロメーター 分光光度計
励起560nm / 蛍光590nm 測定波長490nm
検出感度 800 cells 1000 ~ 2000 cells
測定原理 レサズリンの還元により生じるレゾルフィンの蛍光を測定 テトラゾリウム塩(INT)の還元により生じるホルマザン産物の測定

*Stop Solutionは別途、添加します。

 

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CytoTox-ONE™ (蛍光検出)

Q. CytoTox-ONE™とはどのような製品ですか?

A. 化学物質などの薬剤(試験物質)の添加によって細胞毒性が誘導され、傷害を受けた細胞膜から放出されるLDHを蛍光検出で測定するキットです。CytoTox-ONE™の試薬は、生細胞にはほとんどダメージを与えませんので、細胞を培養したプレートに直接、試薬を添加することができます。試薬添加後は、10分間のインキュベーションで蛍光を測定できる簡便なアッセイです。

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Q. CytoTox-ONE™の測定原理を教えてください。

A. 細胞から放出されたLDHは、乳酸(Lactate)の脱水素化を触媒し、ピルビン酸(Pyruvate)とNADHを生成します。このNADHはジアホラーゼ(Diaphorase)の触媒によりレサズリン(Resazurin)を還元し、レゾルフィン(Resorufin)を生成します。生成したレゾルフィンの蛍光をフルオロメーター(励起560nm/蛍光590nm)で測定します。レゾルフィンによる蛍光値の変化はLDH量に比例します。

図 CytoTox-ONE™の測定原理

 

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Q. CytoTox-ONE™の測定に適したプレートを教えてください。

A. 蛍光測定を行いますので、黒色の不透明な平底プレートをご使用ください。また、プレート底が透明なクリアボトムプレートもお使いいただけます。(例;Corning #3603)
透明なプレートで薬剤による細胞毒性を誘導する実験を行った場合には、その上清を黒色の不透明な平底プレートに移してから測定を行ってください。

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Q. CytoTox-ONE™ の保存条件を教えてください。

A. キットに含まれる全ての製品は-20℃で遮光保存です。Substrate Mix とAssay Bufferを混合したCytoTox-ONE™ Reagent は、遮光して、室温で3日間、4℃で1週間、-20℃で6-8週間保存できます。CytoTox-ONE™ Reagentは繰り返し凍結融解することで、パフォーマンスが低下しますので、あらかじめ小分けして保存されることをお薦めします。

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Q. CytoTox-ONE™ の使用方法を教えてください。

A. CytoTox-ONE™ Substrate Mix をAssay Buffer(製品添付) で溶解し、CytoTox-ONE™ Reagentを調製します。この溶液が室温になっていること確認し、細胞培養液と等量を添加します。(100μlの培養液に対して100μlのCytoTox-ONE™ Reagentを添加)30秒間混合し、22℃で10分間インキュベーション後、フルオロメーター(励起560nm/蛍光590nm)で測定します。
時間を置いてから測定する場合や、高い再現性を求める場合などは、10分間のインキュベーション後にStop Solution(製品添付)を添加してください。試薬に含まれるレサズリンと生成されるレゾルフィンは、高い光感受性を持ちますので、インキュベーションの際は、必ず遮光してください。
このアッセイは、細胞から培地中に放出されたLDHを測定しますので、細胞を含まない、培地のみの陰性コントロールが必要です。この陰性コントロールが、バックグラウンド(ブランク)になるため、試験区の蛍光値からブランクの蛍光値を差し引き、LDHの活性とします。細胞毒性は次のようにして求めます。

細胞毒性 (%)=(実験区-ブランク)/(最大LDH放出量-ブランク)× 100

詳しい使用方法は製品プロトコール(TB306)をご参照ください。

 

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Q. CytoTox-ONE™を使用して最大LDH放出量はどのように測定しますか?

A. 製品には、Lysis Solution (9% w/v solution of Triton® X-100 in water)が添付されています。100μlの細胞培養液あたり2μl のLysis Solutionを添加することで、細胞が溶解され、その後CytoTox-ONE™ Reagentを添加して測定することで最大LDH放出量を求めることができます。

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Q. CytoTox-ONE™ のアッセイに影響を及ぼす要因には何がありますか?

A. 血清とピルビン酸が挙げられます。血清は、バックグラウンドの上昇を引き起こす可能性もあります。血清の影響は、濃度を低くすることで改善することができます。また、培地に含まれるピルビン酸も反応に大きく影響する可能性がありますので、可能ならばピルビン酸を除くことをお薦めします。もしくは、蛍光値のシグナルを増加させるために、反応温度を22℃以上(37℃以下)にすることもできます。

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Q. CytoTox-ONE™ を使用する際に、細胞数について留意することはありますか?

A. 細胞毒性試験を行う前に、適切な細胞数を設定する必要があります。培養細胞の希釈液列を作製し、各細胞数での最大LDH放出量との蛍光値relative fluorescence units (RFUs)との相関性を求め、直線性が得られる細胞数の範囲で実験を行ってください。
L929 細胞の場合、384ウェルプレートを用いたアッセイでは最少細胞数195 cellsから、12,500 cells/wellまで直線性が得られています。96ウェルプレートを用いたアッセイでは最少細胞数781 cells から50,000 cells/wellまで直線性が得られています。

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Q. 添加する.試験物質に関して留意することはありますか?

A. CytoTox-ONE™アッセイに試験物質、あるいは試験物質の溶媒が及ぼす影響をを確認する必要がありますので、次の項目について検討してください。

  1. 試験物質の自家蛍光を測定するため、培地と試験物質だけで、CytoTox-ONE™ Reagentを添加し、バックグラウンドを測定してください。
  2. レサズリンからレゾルフィンへの変換反応に試験物質が及ぼす影響を調べるため、最大LDH放出量を測定するサンプルに試験物質を添加し、測定してください。
  3. 溶媒がアッセイへ及ぼす影響を調べるため、試験物質の溶媒のみを培養細胞に添加して、細胞毒性試験を行います。

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Q. フルオロメーターに560nm と 590nmのフィルターセットがない場合はどうすればよいでしょうか?

A. レゾルフィンの蛍光測定において、励起波長560nm /蛍光波長 590nmが最適ですが、励起波長は530–570nm、蛍光波長は580–620nmの範囲で測定可能です。しかし、最適波長以外での測定は、検出感度を低下させる可能性がありますので、細胞数と蛍光値との相関関係をご確認ください。RPMI + 10% ウシ胎児血清存在下でのレゾルフィンの蛍光スペクトル特性は以下の図のようになります。

図 レゾルフィンの蛍光スペクトル

 

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Q. 毒性試験CytoTox-ONE™と増殖試験CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay(以下CellTiter-Glo®)もしくはCellTiter Blue™ Cell Viability Assay(以下CellTiter Blue™)で測定した結果において、IC50 値(50%の阻害が起きる濃度)の相関性はありますか?

A. IC50の相関性はあります。L929 細胞をTNFαで細胞毒性を誘導した実験において、細胞から放出されたLDHを測定するCytoTox-ONE™と細胞内のATPを測定するCellTiter-Glo®を用いて測定した結果は以下の図のようになります。

図 CytoTox-ONE™とCellTiter-Glo®によるIC50値の相関性

また、HepG2細胞にTamoxifen (0–150µM)を添加し、細胞毒性を誘導する実験においてCytoTox-ONE™とCellTiter Blue™(レサズリンの還元によって細胞数を見積もる)との間にも以下のグラフに示したようにIC50の相関性があります。

図 CytoTox-ONE™とCellTiter Blue™によるIC50値の相関性

 

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Q. プロメガのCytoTox-ONE™とCellTiter-Blue™はどちらもレサズリンを使用しますが、どのような原理の違いがありますか?

A. CytoTox-ONE™の場合は、ジアホラーゼを介して、レサズリンをレゾルフィンに変換する酵素反応(25℃以下)です。これに対して、CellTiter-Blue™は、生細胞の代謝によって、レサズリンを還元してレゾルフィンに変換する反応(37℃以下)です。

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Q. CytoTox-ONE™とプロメガの他のアッセイを同じサンプルを用いて測定するマルチアッセイは可能ですか?

A. 可能です。サンプルとなる培養細胞から、培養上清を別のプレートに移してLDHを測定することができます。残りの細胞を用いて、増殖試験やアポトーシスアッセイを組み合わせることができます。詳しいプロトコールなどは、以下の技術資料あるいはテクニカルサービスまでお問い合わせください。

Cell Note No.10
http://www.promega.com/cnotes/cn010/cn010_15.pdf

 

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Q. CytoTox-ONE™の使用実績を教えてください。

A. プロメガでは、細胞増殖/毒性試験の製品に関する使用実績をCell Viability Assistantとしてホームページ上で検索できるようにしています。こちらをご参照ください。

http://www.promega.com/techserv/tools/cellviaasst/

 

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CytoTox 96® (発色検出)

Q. CytoTox 96®はどのような製品ですか?

A. CytoTox 96®は、細胞毒性により傷害を受けた細胞膜から放出されるLDHをNon-RIの発色検出により測定するシステムです。そのため、放射性同位元素やその廃棄物の処分が不要であり、可視光を使った標準的な96ウェルプレートリーダーで簡単にデータを得ることができます。

測定の原理は次のようになります。細胞から放出されたLDHは、乳酸(lactate)の脱水素化を触媒し、ピルビン酸(pyruvate)とNADHを生成します。このNADHは、ジアホラーゼ(Diaphorase)の触媒によりテトラゾリウム塩(INT)を還元し、赤色を呈するホルマザン(formazan)産物に変換します。生成されたホルマザン産物量は490 nmの吸光値をプレートリーダーで測定し、LDH活性を測定することができます。

 

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Q.  CytoTox 96®の試薬の保存条件と保存期間はどれぐらいですか?

A. Substrate MixとAssay Bufferは‐20℃で保存してください。再溶解したSubstrate Mixは‐20℃で6~8週間保存できます。しかし、繰り返し凍結融解することで、パフォーマンスが低下しますので、あらかじめ小分けして保存されることをお薦めします。
LDH Positive Control、Lysis Solution (10×)、Stop Solutionは4℃で保存してください。

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Q. CytoTox 96®51Cr放出試験の結果の相関性はありますか?

A. あります。
プロメガ及び他の研究機関の実績によりCytoTox 96®51Cr放出試験の間で十分な相関関係があることが示されています。詳しくは以下の参考文献をご参照ください。

Decker, T., et al. (1988). J. Immunol. Methods 115, 61.

Korzeniewske, C., et al. (1983). J. Immunol. Methods 64, 313.

 

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Q. CytoTox 96® の使用方法を教えてください。

A. CytoTox 96®は、細胞を介した細胞毒性試験、化学物質などの薬剤を介した細胞毒性試験、総細胞数の測定に使用することができます。

細胞を介した細胞毒性試験は、ターゲット細胞に対するエフェクター細胞の傷害作用を細胞毒性として測定します。まず、ターゲット細胞数の最適化を行い、以下のようなコントロールを設定して、アッセイを行います。
(1) エフェクター細胞の自然放出LDH量 (2) 実験区(ターゲット細胞に対するエフェクター細胞の傷害作用) (3) ターゲット細胞の自然放出LDH量 (4) ターゲット細胞からの最大LDH放出量 (5) Lysis Solutionの添加による液量補正用コントロール (6) 培養液のみのバックグラウンド(ブランク)

(1)、(2)、(3)、で得られたそれぞれの吸光値の平均値から (6) のブランクの平均値を差し引きます。(4) で得られた吸光値の平均値から(5) の液量補正用コントロールの吸光値の平均値を差し引きます。以下の計算式にしたがって細胞毒性のパーセントを算出します。

細胞毒性 (%) =

(実験区-エフェクター自然放出量-ターゲット自然放出量)/(ターゲット最大放出量-ターゲット自然放出量)

× 100

化学物質などの薬剤を介した細胞毒性試験は、薬剤による傷害作用を細胞毒性として測定します。使用する細胞数の最適化を行い、以下のようなコントロールを考慮してアッセイを行います。
(1) 細胞から自然に放出されるLDH量 (2) 試験する化合物やその中間伝達物質の影響 (3) 細胞からの最大LDH放出量

培地のみから成るバックグラウンドコントロールは"ブランク"として使用します。細胞毒性試薬(X軸:対数目盛)に対するLDHの放出量(Y軸:490nmにおける吸光度)をプロットし、IC50値(50%の阻害が起きる濃度)を評価します。

総細胞数の測定は、あらかじめ細胞の希釈液列にLysis Solution (10X)を添加し、CytoTox 96®の試薬を添加して得られる吸光値を測定することで、細胞数と吸光値の相関関係を求めます。細胞数とLDH活性として示される吸光値は比例しますので、サンプル中の細胞数を見積もることができます。

詳しい使用方法は製品プロトコール(TB163)をご参照ください。

 

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Q. CytoTox 96®のバックグラウンドの吸光値に影響を与える要因には何がありますか?

A. エフェクター細胞や標的細胞から自然に放出されるLDH、培地中 (血清) に存在するLDH、フェノールレッドなどが影響を与えます。コントロールはこれらの要因を補正するために必要です。また、フェノールレッドの除去、血清を得る動物種の変更、培養液中の血清濃度を下げることにより、バックグラウンドを低下させることができます。

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Q. 細胞種によって最適なターゲット細胞数は異なりますか?

A. 異なります。プロメガでは、CytoTox 96 Non-Radioactive Assayに適用するための最適な標的細胞数を決定し、十分なシグナル/ノイズ比を確認するために、予備実験の実施をお薦めします。これは標的細胞種によって異なった量のLDHを含んでいるためです。一般的には、約5,000~10,000 cells/ウェルから始めます。白血球では現在のところ情報がないのですが、一般的に使われる細胞の2~3倍以上の細胞数が必要であるといわれています。

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Q. 添加する試験物質に関して留意することはありますか?

A. CytoTox 96®アッセイに試験物質、あるいは試験物質の溶媒が影響を与えないかを確認してください。LDHの定量に影響が予想される試薬としては、酸化・還元剤として働く試薬が挙げられています。キットに添付しているpositive control LDHに試験物質を加え、アッセイにおける試験物質の影響を確認してください。

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Q. プレートリーダーを490nmに設定できない場合、どうすればよいでしょうか?

A. 最適波長は、490nmですが、470~570nmの波長を使用して測定できます。最適波長以外での測定は、検出感度を低下させる可能性がありますので、細胞数と吸光値との相関関係をご確認ください。

図 ホルマザン吸光スペクトル

 

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Q. Lysis Solution (10X)の組成を教えてください。

A. CytoTox 96®システムに添付しているLysis Solution (10X)は、9%(v/v) Triton® X-100水溶液です。10× Lysis Solutionによってほとんどの細胞を溶解することができますが、まれに界面活性剤に耐性を示す細胞種があります。そのような耐性を示す細胞種では、Lysis Solution (10X)の添加量を増やしてください。

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Q. Positive control のLDH濃度(uni™L)を教えてください。

A. Positive control 中LDHは、1.6 units/uLです。原液5000倍希釈のもので、13,500個のL929繊維芽細胞に存在する酵素活性に相当します。

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Q. CytoTox 96®アッセイを行ったプレートを保管し、後で測定することができますか?

A. お薦めできません。CytoTox 96®Assayを行ったプレートは、Stop Solutionで反応を停止後、1時間以内に測定しなければなりません。

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Q. 後日に解析するためにサンプルを保管できますか?

A. LDHは非常に安定的な酵素です。キャリアータンパク質*)を加えておけば、後日解析するために保管できます。分注して、4℃に保管してください。サンプルを凍結保存した場合、アッセイに用いる前に室温に戻すことが重要です。

*)培地中の血清のことを示します。無血清培地を使用した場合は、例えば10mg/mL以上のBSAを
添加してください。

 

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Q. 標的細胞から自然に放出されるLDHの値を少なくするための注意点はありますか?

A. LDHは細胞膜が損傷していないことや細胞が生存していることを確認するための優れたマーカーであり、トリパンブルー染色よりも高い感度を示します。ターゲット細胞からどれだけの量のLDHが自然に放出されているかは、アッセイ前の諸条件によるため、予備実験によって確認してください。ターゲット細胞がアッセイ前に過増殖(1.5×106 cells/ml以上)してしまうと、細胞膜の透過性が増してLDHが漏れやすくなります。他にもLDHの漏洩の原因となる操作として、高速(250×g以上)での遠心、培地交換や細胞洗浄の際の急激な温度の変化、細胞を再懸濁する時の過剰なピペッティングが挙げられます。

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Q. CytoTox 96®の使用実績を教えてください。

A.  プロメガでは、細胞増殖/毒性試験の製品に関する使用実績をCell Viability Assistantとしてホームページ上で検索できるようにしています。こちらをご参照ください。

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