プロメガ製品 Q & A 【 免疫・抗体 】

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Emax® ImmunoAssay System

Q. Emax® ImmunoAssay Systemとはどのようなキットですか?

Q. Emax® ImmunoAssay System に適したプレートはありますか?

Q. Emax® ImmunoAssay Systemはどのような動物種のサンプルでもアッセイすることができますか?

Q. キットに添付されている試薬およびスタンダードの保存条件を教えてください。

Q. スタンダード溶液は、どのように調製しますか?

Q. スタンダード溶液の単品販売はありますか?

Q. Emax® ImmunoAssay Systemで使用するための前処理の方法を教えてください。

Q. 組織を溶解するには、どのようなバッファーを使用しますか?

Q. サンプルの希釈方法を教えてください。

Q. 検出シグナルを強くすることはできますか?

Q. サンプルを酸処理すると、どうして発色の強度が高くなるのですか?

Q. Emax® ImmunoAssay Systemに含まれるスタンダードは、実験に使うサンプルと同様に酸処理により活性化したほうがいいのですか?

Q. サンプルとスタンダードの反応が遅いようです。反応速度を速くするにはどうしたらよいですか?

 

Emax® ImmunoAssay System

Emax® ImmunoAssay Systemとはどのようなキットですか?

プロメガのEmax® ImmunoAssay Systemは、血清、細胞培養上清、組織抽出液などの生物サンプルに含まれるBDNF、GDNF、TGFβ1の定量を行えます。注: 製品により推奨するサンプルが異なります。詳細は製品マニュアルをご覧ください。

Emax® ImmunoAssay Systemでは感度と特異性を上げるために、2種類の抗体を使ったサンドイッチELISA法を採用しています。この方法では、目的のタンパク質は、あらかじめプレートに固定化された特異的な抗体と結合し、異なったエピトープを認識する2次抗体によって検出されます。ELISAの結果がウェスタンブロットやmRNAの解析結果と一致した場合、特異的なタンパク質の発現についてより確証のあるデータを得ることができます。

Emax® ImmunoAssay Systemは非常に高感度で、1mLのサンプル当たりpg単位のタンパク質を認識できます。それぞれのEmax® Systemには認識および検出用の抗体、酵素標識した二次抗体、ブロッキング試薬、ペルオキシダーゼ用発色基質TMBが400サンプル分含まれています。

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Emax® ImmunoAssay System に適したプレートはありますか?

Thermo Electron Immulon®-4 HBX、Nunc MaxiSorp™、Corning Costar®のプレートで試験済みです。各キットの推奨するプレートについては表1をご覧ください。推奨するプレートを使った場合、添付プロトコルに従えば、各抗体の希釈度を最適化する必要はありません。

表1 Emax® ImmunoAssay Systemで推奨するプレート

製品名 カタログ番号 推奨プレート
BDNF G7610 (2x96 wells)
G7611 (5x96 wells)
Immulon®-4HBX、MaxiSorp™、Corning Costar®
GDNF G7620 (2x96 wells)
G7621 (5x96 wells)
Immulon®-4HBX、MaxiSorp™
TGFβ1 G7590 (2x96 wells)
G7591 (5x96 wells)
Immulon®-4HBX、MaxiSorp™、Corning Costar®


メーカー 製品名 型番 価格
Thermofisher
(大日本製薬(株))
Immulon®4HBX
(イムロン4HBX)
Cat# FN-3855
(Cat# L-3855)
20,400円(50枚)
Nalgen Nunc MaxiSorp™
(マキシソープ)
Cat# 439454
(Cat# 442404)*1)
36,000円(60枚)
22,800円(60枚)
Corning Coaster® EIA/RIA プレート Cat# 3590 37,800円(100枚)

*1) Cat#442404は、保証書がありません。Cat# 439454は保証書がついています。

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Emax® ImmunoAssay Systemはどのような動物種のサンプルでもアッセイすることができますか?

各動物種での交差性(反応性)については、表2をご参照ください。

表2 Emax® ImmunoAssay Systemの動物種別交差性

製品名 ヒト マウス ラット ウサギ アカゲ
ザル
ヤギ ヒツジ ウシ ブタ ウマ ニワトリ
BDNF + + +
GDNF + + + nt nt nt nt
TGFβ1 + + + nt

(+)=交差 ; (p)=アミノ酸配列から交差が予想される(未経験) ; (nt)=未経験 ; (-)=不可


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キットに添付されている試薬およびスタンダードの保存条件を教えてください。

試薬は-20℃で半年間安定です。融解後は、4℃で3ヶ月間保存することができます。

スタンダードは4℃で保存してください。スタンダードを希釈する際には、スタンダードの原液は氷上に置き、室温まで上げないように留意してください。なお、TGFβ1 のスタンダードは凍結しないでください。

スタンダードの希釈溶液は、使用当日に調製してください。調製後の試薬は、後日使用することはできません。

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スタンダード溶液は、どのように調製しますか?

プロメガでは、スタンダード溶液をまず、チューブを用いて2段階希釈します。これをプレート上に移して2倍段階希釈で調製することを推奨します。

例えば図1に示すとおり、標準的な96ウェルプレートでは、ウェル番号11と12のB列からG列にBlock & Sample 1X Bufferを100μL加えます。次に、ウェル番号11と12のA列に希釈したスタンダードを200μL加えます。A列からスタンダードを100μL取り、B列に移します。6回ピペッティングを行い、撹拌します。B列から100μL取り、C列に移します。6回ピペッティングを行い、撹拌します。この操作を列Gまで繰り返します。G列の撹拌操作後、100μLを除きます。この操作によりスタンダードカーブに必要な2倍段階希釈したスタンダードを準備します。H列は、バックグラウンドを取るために100μL Block & Sample 1X Bufferのみを入れます。

図1 アッセイサンプルとスタンダードを測定する際のウェルの推奨位置


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スタンダード溶液の単品販売はありますか?

プロメガでELISA用のスタンダードの単品販売はありませんが、表3に示すプロメガ製品はELISAのスタンダードとして使用することができます。

表3 ELISAのスタンダードとして使用できる製品

製品名 rhBDNF rhGDNF  
カタログ番号
サイズ
G1491
5μg
G2781
25μg
G5141
100μg
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Emax® ImmunoAssay Systemで使用するための前処理の方法を教えてください。

前処理の方法を紹介します。

【1】 培養細胞上清

  1. 室温で 1,500-2,000 x g、15-20 分間遠心する。
  2. 上清液をアッセイに使用する。当日使用するサンプルは、0-4°Cで保存する。後日使用するサンプルは、-70°C で凍結保存する。
  3. アッセイする前に、再度遠心する(1,500-2,000 x g、15-20 分間)。
  4. 使用するバッファー(使用した細胞培養用の培地等)に希釈してアッセイする。

【2】 血清

  1. 血液を室温で10-15分間凝固させる。
  2. ピペットで凝固部分を採取する。
  3. 血清を室温で1500-2000 x g、15-20分間遠心する。
  4. 上清液をアッセイに使用する。当日使用するサンプルは、0-4°Cで保存する。後日使用するサンプルは、-70°C で凍結保存する。
  5. アッセイする前に遠心する(1,500-2,000 x g、15-20 分間)。

【3】 血漿

  1. 抗凝固剤としてEDTAなどが入っている採血管を使用する。クエン酸は、アッセイの影響を受けるため、サンプルは希釈して使用する。スタンダードは、サンプルと同じ溶液で希釈し、調製してください。
  2. 採取後は、ただちに血液を攪拌する。
  3. 室温で10-15分間インキュベートする。
  4. 室温で 1500 x g 、15-10 分間遠心する。
  5. 上清液をアッセイに使用する。当日使用するサンプルは、0-4°Cで保存する。後日使用するサンプルは、-70°C で凍結保存する。
  6. アッセイする前に遠心する(1,500-2,000 x g、15-20 分間)。

【4】 尿

  1. 室温で1500-2000 x g 、15-20 分間遠心する。
  2. 上清液を0.2μmのフィルターでろ過する。
  3. ろ液をアッセイに使用する。当日使用するサンプルは、0-4°Cで保存する。後日使用するサンプルは、-70°C で凍結保存する。
  4. アッセイする前に遠心する(1,500-2,000 x g、15-20 分間)。
  5. クレアチニンレベルを補正する。

【5】 細胞組織

  1. 組織サンプルの重量を計測する。
  2. 溶解バッファー(バッファー組成) に懸濁する。溶解バッファーは、なるべく少ない容量で使用してください。組織の表面部分のサンプルで、測定には十分量あります。
  3. 組織をホモジネートする。
  4. 室温で1500-2000 x g 、15-20 分間遠心する。
  5. 上清液をアッセイに使用する。当日使用するサンプルは、0-4°Cで保存する。後日使用するサンプルは、-70°C で凍結保存する。
  6. アッセイする前に遠心する(1,500-2,000 x g、15-20 分間)。
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組織を溶解するには、どのようなバッファーを使用しますか?

プロメガでは非イオン性の界面活性剤とプロテアーゼ阻害剤を含んだ緩衝液を推奨しています。SDSの使用は避けてください。プロメガでは1% NP40、10% glycerol、1mM PMSF、10μg/mL aprotinin、1μg/mL leupeptin、0.5mM Sodium Orthovanadateを含むTris緩衝液(20mM Tris-HCl, pH 8.0、137mM NaCl)を使用しています。

良好な結果を得るために、サンプルのタンパク質濃度は少なくとも1mg/mLとなるよう抽出液を作製してください(1)。アッセイで界面活性剤による阻害を最小限に抑制するために、非イオン性の界面活性剤で可溶化したサンプルを希釈してください。

参考文献(1): Okragly, A.J. and Haak-Frendscho, M. (1997) Exp. Neurol. 145, 592.

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サンプルの希釈方法を教えてください。

サンプルに含まれるタンパク質量が1mg/mL以上の場合、可溶化バッファーで希釈してください。

なお、タンパク質量が1mg/mL以下の場合、希釈せずにトリプリケート(n=3)でアッセイしてください。

TGFβ1のサンプルでは、Sample 1X Bufferを使って希釈してください。
なお、TGFβ1のサンプルにBSAを使用しないでください。標準的なBSA調製品にはウシのTGFβ1が含まれており、これらがアッセイを阻害し、誤った結果となる可能性があります。

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検出シグナルを強くすることはできますか?

組織抽出液を使用したサンプルの酸処理後、塩基を用いて中和すると、シグナルが強くなる場合があります(1)。たとえば、マウスの脳・膀胱・腎臓・肺・心臓・筋肉・脾臓の抽出液では、酸処理後にこれらの組織からGDNFの検出が可能です(1)。しかし、可溶化した後、そのままGDNFの検出に用いた場合は、何も検出できません。

参考文献(1): Okragly, A.J. and Haak-Frendscho, M. (1997) Exp. Neurol. 145, 592.

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サンプルを酸処理すると、どうして発色の強度が高くなるのですか?

酸処理により、リガンド―レセプターまたは、リガンド―細胞外ドメイン(レセプター)との結合が切り離され、タンパク質が抗体によって認識され易くなると考えられています。

TGFβにおける酸処理による現象はよく研究されています(2)。キャリアータンパクとして結合しているTGFβは、酸処理によって、結合に関与するペプチドとTGFβ分子との非共有結合が切断されます。遊離したTGFβは活性化型です。このような過程が酸処理と呼ばれていますが、神経栄養因子では、この機構は完全に解明されていません。

参考文献(2):Lyons, R.M. et al.(1988) J. Cell Biol. 106, 1659.

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Emax® ImmunoAssay Systemに含まれるスタンダードは、実験に使うサンプルと同様に酸処理により活性化したほうがいいのですか?

Emax® ImmunoAssay Systemに含まれるスタンダードは、検出するために酸処理での活性化を必要としない組み換えタンパク質です。したがって、スタンダードは酸処理をする必要はありません。

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サンプルとスタンダードの反応が遅いようです。反応速度を速くするにはどうしたらよいですか?

MB One Solutionが使用前に室温に戻っていることを確かめてください。発色反応時にプレートを振とうすることによっても反応速度を速くできます。しかし、検出試薬の濃度を高くしても反応速度は速くなりません。

<参考>
Emax® ImmunoAssay Systemは、プレートの振とうを行わなくても使用できます。プロメガでは、振とうを行わずに試験を行い、直線性を示す反応を確認しています。ただし、スタンダードは直線性を示しますが、結果として得られる吸光度の最高値が10~15%減少します。

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