プロメガ製品 Q & A 【 HiBiT 】

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HiBiT

Q. HiBiT塩基配列を人工合成、ペプチド合成してもよいですか?

Q. HiBiTのアミノ酸配列は?

Q. HiBiTベクターの配列情報およびベクターマップはどこで入手できますか?

Q. HiBiTベクターはN末端付加用、C末端付加用がありますが、どのように選択すればよいですか?

Q. HiBiTと目的タンパクの間にリンカーは必要ですか?またその長さを検討する必要はありますか?

Q. ORF内部にHiBiTを挿入してもワークしますか?

Q. 分泌型の融合ベクターはどのような時に使用しますか?

Q. ゲノム編集に応用するためには何を準備すればよいですか?

Q. 論文実績はありますか?

Q. HiBiTとLgBiTの結合はどのくらい強いですか?

Q. NanoBiTのSmBiTとHiBiTの違いは何ですか?

Q. 動物細胞以外 (植物、菌、酵母など) でも使用できますか?

Q. ブロッティングの検出感度は一般的なタグとくらべて高いですか?

Q. HiBiT 抗体はありますか?

Q. LgBiT 発現ベクターの単品販売はありますか?

Q. 一般的な蛍光顕微鏡でイメージングできますか?

Q. 検出にはどのような機器が必要ですか?

Q. HiBiTのサブクローニング受託はしていますか?

 

HiBiT

HiBiT塩基配列を人工合成、ペプチド合成してもよいですか?

ラベルライセンスの内容を承認、登録して頂く必要があります(1分で終了する配列利用に関する簡単な登録です)。
下記サイトよりご登録ください。

http://www.promega.co.jp/nanobitsynthesis/

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HiBiTのアミノ酸配列は?

HiBiTのアミノ酸配列は下記の通りです。
VSGWRLFKKIS

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HiBiTベクターの配列情報およびベクターマップはどこで入手できますか?

下記の各ベクターの製品情報ページにベクターマップを記載しております。配列情報はベクターマップ下の「sequence text file」よりご確認頂けます。

HiBiT CMV neo Flexi Vectors(カタログ番号:N2391)
https://www.promega.jp/products/protein-quantitation-and-detection/protein-quantitation/hibit-cmv-neo-flexi-vectors/?catNum=N2391

pBiT3-1 MCS Vectors (カタログ番号:N2361)
https://www.promega.jp/products/protein-quantitation-and-detection/protein-quantitation/pbit3-1-mcs-vectors/?catNum=N2361

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HiBiTベクターはN末端付加用、C末端付加用がありますが、どのように選択すればよいですか?

ほとんどのタンパクでN末端、C末端の配向性の違いはありませんので、一般的なアフィニティータグ(HisやFlag、c-Mycなど) 同様、どちらを選択頂いても構いません。ただし、膜タンパク質などN末端にシグナルペプチドがある場合はC末端にHiBiTを付加する、あるいはシグナルペプチドとORFの間にHiBiTを挿入するなどの工夫が必要です。

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HiBiTと目的タンパクの間にリンカーは必要ですか?またその長さを検討する必要はありますか?

基本的にはリンカーは必ずしも必須ではありません。ほとんどのタンパクではFlexi cloning siteまたはマルチクローニングサイトの制限酵素サイトの挿入で得られるリンカーで十分です。タンパクの種類により、稀に立体障害のため、長いリンカーが必要な場合があります。

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ORF内部にHiBiTを挿入してもワークしますか?

タンパク質の内部にHiBiTタグを組み込んでもLgBiTと結合することを社内で検証しております。 Nano-Glo® HiBiT Extracellular Detection System(カタログ番号:N2420)の製品マニュアル20ページに、その際の注意点等を記載しております。

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分泌型の融合ベクターはどのような時に使用しますか?

膜タンパク質などでネイティブなシグナルペプチドを使用しない場合、強制的に細胞膜に移行させる際に使用します。

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ゲノム編集に応用するためには何を準備すればよいですか?

CRISPR/CAS9によるゲノム編集ではガイドRNA、ドナーDNAテンプレート(HiBiTおよびゲノムに相同な配列)、CAS9タンパク(または発現ベクター)が別途必要です。

下記のCRISPR/CAS9ゲノム編集によるHiBiTノックインプロトコルをご参照ください。
http://www.promega.co.jp/hibitcrispr/

また、ゲノム編集を実施する受託メーカーに受託して頂くことも可能です。その際は上記人工合成の際のライセンス登録を行ってください。

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論文実績はありますか?

下記論文実績があります。
CRISPR-Mediated Tagging of Endogenous Proteins with a Luminescent Peptide
http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acschembio.7b00549

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HiBiTとLgBiTの結合はどのくらい強いですか?

HiBiT-LgBiTの親和性はKd=7x10-10Mです。一般的なアフィニティータグ(HisやFlag、c-Myc)の抗体との親和性Kd=2.2x10-9~1x10-5Mに比べ、高い親和性を示します。

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NanoBiTのSmBiTとHiBiTの違いは何ですか?

塩基(アミノ酸)配列が異なります。LgBiTとの親和性はNanoBiTはKD = 190μM と非常に低いのでタンパク間相互作用の解析に使用します。HiBiTはKD = 700 pMと高親和性なので、発光タグとして使用します。

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動物細胞以外 (植物、菌、酵母など) でも使用できますか?

動物細胞以外の実績は現状ありませんが、全長のNanoLuc® ルシフェラーゼは植物、菌、酵母での実績がありますので、原理的には発光検出は可能と考えております。

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ブロッティングの検出感度は一般的なタグとくらべて高いですか?

ブロッティングでは一般的なアフィニティータグと同等または高い感度を示します。Flagタグと比較し、高い感度を示した例があります。

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HiBiT 抗体はありますか?

現状、HiBiT に対する抗体はありません。

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LgBiT 発現ベクターの単品販売はありますか?

現状LgBiT単独の発現ベクターの単品販売は行っておりません。NanoBiT® PPI Starter Systems (カタログ番号:N2014, N2015) に含まれているLgBiTクローニングベクターよりLgBiTを抜き出して作製下さい。

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一般的な蛍光顕微鏡でイメージングできますか?

一般的に使用される蛍光顕微鏡でのイメージングは困難です。HiBiTは発光のイメージングとなり、励起光を当てない測定となりますので、 発光測定用の顕微鏡が必要となります。 プロメガではOlympus LV200 Bioluminescence Imaging Systemを使用しています。

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検出にはどのような機器が必要ですか?

発光定量は一般的な発光測定装置(ルミノメーター)で検出できます。
ブロッティング検出も一般的なルミノイメージアナライザを使用できます。

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HiBiTのサブクローニング受託はしていますか?

受託可能です。別途お問合せください

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