プロメガ製品 Q & A 【 NanoBRET™ 】

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Q. 試薬の保存条件を教えて下さい

Q. 内部標準は必要ですか?

Q. NanoBiTとの違いを教えて下さい

Q. NanoBiTとの使い分けは?

Q. N末端、C末端また、NanoLucとHaloTagの配向について、組み合わせの最適化は必要ですか?

Q. NanoBRET用リガンド以外のHaloTagリガンドは使用できますか?

Q. シグナル持続時間は?

Q. スクリーニングに使えますか?

Q. 標的タンパク質が結合していないのにBRETが起こることはありますか?

Q. リンカー配列の最適化は必要ですか?

Q. BRETシグナルが標的タンパク質の結合に特異的であることはどのように確認でますか?

Q. 普通の蛍光顕微鏡でイメージングできますか?

Q. 測定に使える機器は?

Q. 測定に使えるプレートは?

Q. 安定発現株でアッセイできますか?

Q. 哺乳動物細胞以外での応用は可能ですか?

Q. in vivoで使用できますか?

Q. どのような細胞で実績がありますか?

[ 解 答 ]

Q. 試薬の保存条件を教えて下さい

A. こちらをご参照ください。

NanoBRET™
試薬 保存温度
NanoBRET™ Nano-Glo® Substrate 遮光し、-10℃から-30℃ ※凍結しません
HaloTag® NanoBRET™ 618 Ligand
※用事調製
遮光し、-10℃から-30℃
5回までの再凍結融解が可能

 

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Q. 内部標準は必要ですか?

A. NanoBRET™ではNanoLucの発光値とNanoBRET™ 618 Ligandの発光値の比率により、評価を行うため、内部標準を別途用意する必要はありません。

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Q. NanoBiTとの違いを教えて下さい

A. こちらをご参照ください。

NanoBiT™ とNanoBRET™ の特性比較
特性 NanoBRET™ NanoBiT™
方式 生物発光共鳴 エネルギー転移(BRET) 発光酵素断片の相補性
検出対象 近接度 直接的な相互作用
タグの大きさ 小さい
20 kDa(NanoLuc™)と30 kDa(HaloTag®
非常に小さい
11アミノ酸(SmBiT)と<18 kDa(LgBiT)
データ 2波長の比率(低 %CV) RLU(相対発光強度)
試薬添加回数 2 1
検出機器 アッセイ BRET 対応ルミノメーター
(適合フィルター要)
ルミノメーター
(フィルター不要)
イメージング 発光イメージングシステム
(Olympus LV200 など):
相互作用前後を観察可能
発光イメージングシステム
(Olympus LV200 など):
複合体のみ観察可能
可逆性
(キネティックアッセイ可)
製品形態 キット(100種類以上)、
クローニングベクター、検出試薬
クローニングベクター、
検出試薬
ベクター構築サービスもございます。
ライセンス費用(企業を含む) 試薬の購入のみ
その他 HaloTag側を使ったプルダウン
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Q. NanoBiT™との使い分けは?

A. こちらをご参照ください。

このような場合、NanoBRET or NanoBiT?
実験条件 推奨手法 理由
Peptide - Protein binding NanoBiT™ NanoBRET™の場合、Peptideに NanoLuc(19KDa) あるいはHaloTag(32KDa)を標識するとpeptideの活性に影響が出る可能性
低親和性 (想定Kd >10μM) NanoBRET™ SmBit: LgBitの親和性が190μM であり、標的タンパク間の親和性が低いと、SmBiT:LgBiTの親和性が関与してしまう
分注再現性(ばらつき)に自信がない NanoBRET™ ratio metric なので、ばらつきが補正される
High Throughput NanoBiT™ 発光試薬の添加ステップがBitは1回、BRETは2回、測定もBiTは1回、BRETは2回
単純なLuminometer しかない NanoBiT™ チューブルミノメーターでも可能(浮遊細胞に限る)
Imagingで観察したい NanoBiT™ NanoLuc の 1/3の輝度を確保。NanoBRETは、BRETによる転移効率等により輝度が期待できない上、最適なフィルターが必要。
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Q. N末端、C末端また、NanoLucとHaloTagの配向について、組み合わせの最適化は必要ですか?

A. 必要です。それぞれのタンパクペアについてN末端、C末端の最大8通りの組み合わせについて最適化することをお勧めします。詳細は製品マニュアルをご参照ください。

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Q. NanoBRET™用リガンド以外のHaloTagリガンドは使用できますか?

A. ライセンス上、NanoBRET用リガンド以外のHaloTag ligandを使用することはできません。まずはNanoBRET™用のHaloTag® NanoBRET™ 618 Ligandをご使用ください。NanoBRET用リガンド以外のHaloTagリガンドを使用する場合はライセンス契約の必要があります。プロメガ株式会社マーケティング部へご連絡ください。

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Q. シグナル持続時間は?

A. 4時間までBRETシグナルを検出できることを確認しています。

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Q. スクリーニングに使えますか?

A. 論文化されておりませんが、製薬企業を中心に国内外でスクリーニングに使用されています。

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Q. 標的タンパク質が結合していないのにBRETが起こることはありますか?

A. 標的タンパク質が結合していない場合にはBRETは起こりません。 エネルギー転移が生じる距離は10-100 Å (1-10nm)と言われており、これはBRET・FRETともに共通の値です。標的タンパク同士がこの距離の間で結合している場合以外ではBRETが起こることはありません。

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Q. リンカー配列の最適化は必要ですか?

A. リンカー配列の最適化は基本的には不要です。NanoBRETのリンカーは多くのタンパク質では十分使用できる長さのリンカーとなっています。

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Q. BRETシグナルが標的タンパク質の結合に特異的であることはどのように確認でますか?

A. BRETシグナルが標的タンパク質の結合に特異的であることの確認にはNanoBRET™ 618 Ligandなしのサンプルとの比較をお勧めします。プロメガでは、Ligand (+)のアクセプターシグナルがLigand (-)の2倍以上であることをBRETが生じていると判断する基準としています。 また詳細に確認したい場合はドナー量を一定にしてアクセプター量を減らすアッセイを行ってください。こちらの詳細は製品マニュアルをご参照ください。

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Q. 普通の蛍光顕微鏡でイメージングできますか?

A. 一般的に使用される蛍光顕微鏡でのイメージングは困難です。NanoBRET™は励起光を当てない測定となりますので、 発光測定用の特殊な顕微鏡が必要となります。 プロメガではOlympus LV200 Bioluminescence Imaging Systemを使用しています。

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Q. 測定に使える機器は?

A. 下記の機器で測定可能であることを確認しています。

  • Promega, GloMax Discover;純正フィルダー 450/8BP, 600/LP
  • BMG Labtech, CLARIOstar;純正フィルター 450/80BP, 610LP
  • Thermo Fisher Scientific, Varioskan;Edmunds Opticsフィルター 450/80BP, 610/LP
  • Perkin Elmer, Envision;Chromaフィルター 460/50BP, 600LP mirror luminescence setting
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Q. 測定に使えるプレートは?

A. 弊社では下記のプレートを用いて、NanoBRETの測定を行っています。

  • Corning® 96 Well Solid White Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, 20 per bag, with Lid, Sterile (Product #3917)
  • Corning® 384 Well Low Flange White Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, 10 per Bag, with Lid, Sterile (Product #3570)
上記と同等のプレートであれば、他のプレートでも測定可能です。


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Q. 安定発現株でアッセイできますか?

A. 安定細胞株を用いて、NanoBRET™アッセイを行うことは可能です。 ただし、安定細胞株を用いた場合だと、ドナーシグナル(NanoLuc)とアクセプターシグナル(NanoBRET™ 618 Ligand)の比を調整することが難しくなります。このため、遺伝子導入の量を調整しやすい一過性発現系をお勧めしています。

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Q. 哺乳動物細胞以外での応用は可能ですか?

A. 現状、哺乳動物細胞以外での実績はございません。

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Q. in vivoで使用できますか?

A. 現状、in vivoでの使用例はございません。

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Q. どのような細胞で実績がありますか?

A. HEK293、 HeLa、HCT116、KARPAS422細胞株で実績があります。

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