プロメガ製品 Q & A 【 NanoBiT™ 】

[ メニュー ]

Q. 試薬の保存条件を教えて下さい

Q. ネガティブコントロールの設定はどのようにすればよいのか

Q. NanoBRET™との違いを教えて下さい

Q. NanoBRET™との使い分けは?

Q. N末端、C末端また、LgBiTとSmBiTの配向について、組み合わせの最適化は必要ですか?

Q. 遺伝子導入量の比率を調整する必要はありますか?

Q. SmBiTとLgBiTには親和性がありますか?

Q. 高親和性のNanoBiTの取り扱いはありますか?

Q. NanoBiT™にNanoGloの基質は使用できないか

Q. 内部標準は必要ですか?

Q. リンカー配列の最適化は必要か、どれくらいのサイズ差まで対応できますか?

Q. 一般的な蛍光顕微鏡でイメージングできますか?

Q. 経時的な長時間のアッセイをすることは可能ですか?

Q. 測定に使用できる機器は?

Q. 測定に使用できるプレートは?

Q. 安定発現株でアッセイできますか?

Q. 阻害剤や化合物を添加してからどれくらいの時間から測定できますか?

Q. 哺乳動物細胞以外での応用は可能ですか?

Q. in vivoで使用できますか?

Q. LgBiTとSmBiTの会合を阻害する条件や化合物はありますか?

Q. どのような細胞で実績がありますか?

[ 解 答 ]

Q. 試薬の保存条件を教えて下さい

A. こちらをご参照ください。

NanoBiT
試薬 保存温度
調製前 Nano-Glo® Live Cell Substrate -20℃ ※凍結しません
Nano-Glo® LCS Dilution Buffer 初回に融解後は室温
プラスミドDNA構成品 –20℃
調製後 Nano-Glo® Live Cell Reagent
※用事調製
調製後の安定性
20℃、3時間で10%の活性低下
4℃、7時間で10%の活性低下

 

メニューQ&Aもくじ日本語ホーム

Q. ネガティブコントロールの設定はどのようにすればよいのか

A. 添付のNegative Control Vectorをご使用ください。Negative Control VectorはHaloTag®-SmBiTです。Negative Control Vectorとご使用のLgBiT融合タンパクとの組み合わせをネガティブコントロールの条件としてご使用ください。使用方法の詳細は製品マニュアルをご参照ください。

メニューQ&Aもくじ日本語ホーム

Q. NanoBRET™との違いを教えて下さい

A. こちらをご参照ください。

NanoBiT™ とNanoBRET™ の特性比較
特性 NanoBRET™ NanoBiT™
方式 生物発光共鳴 エネルギー転移(BRET) 発光酵素断片の相補性
検出対象 近接度 直接的な相互作用
タグの大きさ 小さい
20 kDa(NanoLuc™)と30 kDa(HaloTag®
非常に小さい
11アミノ酸(SmBiT)と<18 kDa(LgBiT)
データ 2波長の比率(低 %CV) RLU(相対発光強度)
試薬添加回数 2 1
検出機器 アッセイ BRET 対応ルミノメーター
(適合フィルター要)
ルミノメーター
(フィルター不要)
イメージング 発光イメージングシステム
(Olympus LV200 など):
相互作用前後を観察可能
発光イメージングシステム
(Olympus LV200 など):
複合体のみ観察可能
可逆性
(キネティックアッセイ可)
製品形態 キット(100種類以上)、
クローニングベクター、検出試薬
クローニングベクター、
検出試薬
ベクター構築サービスもございます。
ライセンス費用(企業を含む) 試薬の購入のみ
その他 HaloTag側を使ったプルダウン
メニューQ&Aもくじ日本語ホーム

Q. NanoBiT™との使い分けは?

A. こちらをご参照ください。

このような場合、NanoBRET or NanoBiT?
実験条件 推奨手法 理由
Peptide - Protein binding NanoBiT™ NanoBRET™の場合、Peptideに NanoLuc(19KDa) あるいはHaloTag(32KDa)を標識するとpeptideの活性に影響が出る可能性
低親和性 (想定Kd >10μM) NanoBRET™ SmBit: LgBitの親和性が190μM であり、標的タンパク間の親和性が低いと、SmBiT:LgBiTの親和性が関与してしまう
分注再現性(ばらつき)に自信がない NanoBRET™ ratio metric なので、ばらつきが補正される
High Throughput NanoBiT™ 発光試薬の添加ステップがBitは1回、BRETは2回、測定もBiTは1回、BRETは2回
単純なLuminometer しかない NanoBiT™ チューブルミノメーターでも可能(浮遊細胞に限る)
Imagingで観察したい NanoBiT™ NanoLuc の 1/3の輝度を確保。NanoBRETは、BRETによる転移効率等により輝度が期待できない上、最適なフィルターが必要。
メニューQ&Aもくじ日本語ホーム

Q. N末端、C末端また、NanoLucとHaloTagの配向について、組み合わせの最適化は必要ですか?

A. 必要です。それぞれのタンパクペアについてN末端、C末端の最大8通りの組み合わせについて最適化することをお勧めします。詳細は製品マニュアルをご参照ください。

メニューQ&Aもくじ日本語ホーム

Q. 遺伝子導入量の比率を調整する必要はありますか?

A. 基本的にLgBiTとSmBiT融合タンパクについて1:1の比率での導入を推奨しています。

メニューQ&Aもくじ日本語ホーム

Q. SmBiTとLgBiTには親和性がありますか?

A. KD = 190μM です。

メニューQ&Aもくじ日本語ホーム

Q. 高親和性のNanoBiT™の取り扱いはありますか?

A. 現在開発中です。詳細をご希望の方はプロメガテクニカルサービス部までお問い合わせください。

メニューQ&Aもくじ日本語ホーム

Q. NanoBiTにNanoGloの基質は使用できないか

A. Nano-Glo基質は安定性に問題が生じる可能性があるので、使用をお勧めしておりません。NanoBiTの基質・バッファーはバックグラウンドが低く、長時間発光が持続するよう、組成を調整しております。

メニューQ&Aもくじ日本語ホーム

Q. 内部標準は必要ですか?

A. 内部標準は不要です。経時測定のため刺激前のベースラインシグナルに対する刺激後のシグナルを相対値で算出し、比較してください。詳細は製品マニュアルをご参照ください。

メニューQ&Aもくじ日本語ホーム

Q. リンカー配列の最適化は必要か、どれくらいのサイズ差まで対応できますか?

A. 製品内のベクターはリンカーの長さ、配列の最適化を行っており、一般的な大きさのタンパクについては、リンカーの最適化を行う必要はありません。プロメガでは様々な大きさのタンパクペアでの検討を行っており、80 kDaまでのタンパクペアでは問題なく使用できます。

メニューQ&Aもくじ日本語ホーム

Q. 一般的な蛍光顕微鏡でイメージングできますか?

A. 一般的に使用される蛍光顕微鏡でのイメージングは困難です。NanoBiTでは発光のイメージングとなり、励起光を当てない測定となりますので、 発光測定用の顕微鏡が必要となります。 プロメガではOlympus LV200 Bioluminescence Imaging Systemを使用しています。

メニューQ&Aもくじ日本語ホーム

Q. 経時的な長時間のアッセイをすることは可能ですか?

A. 約2時間までのライブアッセイが可能です。

メニューQ&Aもくじ日本語ホーム

Q. 測定に使用できる機器は?

A. 一般的なルミノメーターで測定可能です。

メニューQ&Aもくじ日本語ホーム

Q. 測定に使用できるプレートは?

A. 細胞培養用の白色不透明プレートを推奨しております(Corning Cat.# 3917 等)。クリアボトムプレートも使用できますが、クロストークが生じる可能性があります。

メニューQ&Aもくじ日本語ホーム

Q. 安定発現株でアッセイできますか?

A. 安定発現株でアッセイ可能です。

メニューQ&Aもくじ日本語ホーム

Q. 阻害剤や化合物を添加してからどれくらいの時間から測定できますか?

A. 阻害剤や化合物を添加直後から測定できます。

メニューQ&Aもくじ日本語ホーム

Q. 哺乳動物細胞以外での応用は可能ですか?

A. 現状、哺乳動物細胞以外での実績はございません。基質であるフリマジンの細胞内への透過性に依存します。

メニューQ&Aもくじ日本語ホーム

Q. in vivoで使用できますか?

A. 原理的には使用可能です。ただしNanoLucの短波長の特性上、深部でのイメージングでは組織透過性の問題から、不向きである場合があります。

メニューQ&Aもくじ日本語ホーム

Q. LgBiTとSmBiTの会合を阻害する条件や化合物はありますか?

A. 現状、LgBiTとSmBiTの会合を阻害する化合物は見つかっておりませんが、 化合物スクリーニング等で阻害物質が生じる可能性はあります。

メニューQ&Aもくじ日本語ホーム

Q. どのような細胞で実績がありますか?

A. HEK293、CHO、Hela、U2OS細胞株で実績があります。

メニューQ&Aもくじ日本語ホーム