プロメガ製品 Q & A 【 PCR&RT-PCR 】

 

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PCR

Q.PCRの最適化のために特に重要なパラメーターは何ですか?
Q.どの耐熱性DNA polymeraseが非鋳型依存的に3’末端にAを付加しますか。
Q.鋳型DNAを加えずにPCRを行ってもバンドが出ます。コンタミネーションではないでしょうか?

RT-PCR
Q.逆転写反応にはどんな酵素が使えますか
Q.RT-PCRでpoly (A)+ RNAの代わりにTotal RNAを使えますか
Q.Pfu DNA PolymeraseはRT-PCRに使えますか
Q.RT-PCRにおいてRNAの2次構造に関する問題を解決するために有効な方法とは何ですか。
Q.RT-PCRの産物をクローニングするためにどのような方法が使えますか。
Q.RT-PCRのサンプル調製の時、ゲノムDNAを除くためにはどんな方法が最適ですか。

Access RT-PCR System
Q.Access RT-PCR Systemで増幅できる最長の配列はどれくらいですか
Q.oligo(dT)プライマーまたはランダムヘキサマーをAccess RT-PCR Systemで逆転写プライマーとして使うことができますか
Q.Access RT-PCR Systemの逆転写ステップで、目的の遺伝子に特異的なプライマーの代わりにランダムプライマーやoligo(dT)プライマーを使うことができますか。

Reverse Transcription System

Q.AMV Reverse Transcriptaseに添付されている5× Reaction BufferはReverse Transcription Systemに添付される10× Reverse Transcription Bufferと置き換えて使うことができますか。

 

 PCR

PCR 一般

Q.PCRの最適化のために特に重要なパラメーターは何ですか?

PCRはクローニング、サブクローニング、DNAシークエンシング、遺伝子発現の解析、欠失変異、変異の導入などを含む多くのアプリケーションで有効な手法です(1-3)。PCR増幅を確実に行うために最適化を必要とする重要なパラメーターは、鋳型の選択および精製度、マグネシウム濃度、プライマーデザインおよび濃度、ヌクレオチドの濃度、耐熱性酵素のタイプおよび濃度、サイクルの設定などが挙げられます。

鋳型
: ゲノム、ウイルスDNA、プラスミドのようなベクター、逆転写によって合成されたcDNAなど多種類のDNAが増幅の鋳型として使われます。ゲノムのような複雑な構造の鋳型では約1ng~1μgが使われます。プラスミドやcDNAのような複雑でない標的である鋳型は一般的に10pg~100ngを必要とします(2)。

マグネシウム
: 反応液中のマグネシウム濃度は重要であり、一般的に1.0~5.0mMの範囲で最適化されます。しかし、この濃度は耐熱酵素の種類と同じようにヌクレオチドの濃度に依存して変化します(2,3)。マグネシウム濃度はプライマーのアニーリング、PCR産物の特異性、酵素の活性や忠実性に影響する可能性があります(2)。PCRでは総dNTP濃度からさらに0.5~2.5mMのマグネシウムを含む必要があります(2)。

プライマー: PCRに使うためのプライマーをデザインする時にいくつかの考慮すべき点があります。それらにはオリゴヌクレオチドの長さ、Tm値、配列の物理的な特徴、プライマーの相互作用の可能性、増幅産物の長さ、標的となる鋳型配列上での位置などが含まれます(1-3)。プライマーの濃度は一般的に0.1~0.5μMで使われます。プライマーの濃度が高すぎた場合、ミスプライミングを起こしたり、人造的なPCR産物と呼ばれる非特異的な産物を産生します。一般的なプライマーは18~28 nucleotidesの長さ、Tm値は55~80℃を示し、G/C含量は45~55%です(1,2)。インターネットでの有用なプライマーデザインのためのサイトはwww.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi. です。

ヌクレオチド: ヌクレオチドの溶液はpH7.0に調整し、最終濃度はそれぞれ20~250μMになるように加えます(2)。この濃度では収量、産物の特異性、酵素の忠実性において至適化されたバランスで得られます。各dNTPは取り込みのミスを減らすために等モル濃度で加えてください。dNTPsは遊離のマグネシウムイオンをキレートするので、Mg2+を加えて補正しない場合は過剰のdNTPsを加えないでください。

酵素: PCR用に多種類の耐熱性DNAポリメラーゼが販売されています。これらのポリメラーゼでは耐熱性、忠実度、最適な反応条件が異なっています。耐熱性DNAポリメラーゼの一般的な概要は文献1に詳しく記載されています。Pfuのような耐熱性DNAポリメラーゼは3’→5’方向へのエキソヌクレアーゼ活性を持っているため、平滑末端を持つPCR産物を作成します。一方、エキソヌクレアーゼ活性を持たないTaqのようなその他の耐熱性酵素は1個のアデノシンを付加されたPCR産物を作成します(4)。一般的に100μlの反応には0.5~1.25 unitsの酵素が使われます(2,3)、しかし、特殊なアプリケーションでは酵素の追加が必要な場合があります。酵素濃度が低すぎると、充分量の産物が作成されません。高すぎる場合、非特異的なバックグラウンドのバンドが作成されます(2)。

サイクリング: PCRのサイクル条件は“変性”、“アニーリング”、“伸長”からなる連続のステップを20~30回繰り返します。92~95℃で10~60秒インキュベーションすることで鋳型DNAの変性を行い、続いてプライマーのアニーリングステップを行います。一般的にアニーリングはプライマーのTm値の±5℃の範囲内の温度で10~60秒間行います。酵素による伸長ステップは一般的に72~74度で30~60秒間行われます。これらの条件は目的のPCR産物の鎖長や用いる酵素の特異性によって変更されます。全長の産物を作成するために最初の変性ステップと最後の5~10分の伸長反応が有用な場合があります。

この基本的な増幅のプロフィールを元にして多くのバリエーションを行うことができます。それらのバリエーションは使われているPCRのアプリケーションによります。最近のアプリケーションには、ディファレンシャルディスプレイ(5)で理論的に全てのmRNAを増幅する(続けてcDNAを作成する)ためのdegenerateプライマーを使うものや、希少な目的の配列を検出したり、非特異的な産物の増幅を減少させる(6)ためのnestedプライマーを使う第2ラウンドのPCRの2つがあります。

増幅されにくい鋳型DNAは、DMSO(7)、betain(7)、formamide(8)、single-stranded DNA binding protein(9)などの試薬を添加することで改善することができます。

参考文献

  1. Griffin, H.G. and Griffin, A.M. (1994) PCR Technology: Current Innovations, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL.

  2. Innis, M.A. et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., San Diego, CA.

  3. Mullis, K.B. et al. (1994) The Polymerase Chain Reaction, Birkhauser, Boston, MA.

  4. Clark, J.M. (1988) Nucl. Acids Res. 16, 9677.

  5. McClelland, M., Mathieu-Daude, F. and Welsh, J. (1995) Trends Genet. 11, 242.

  6. Mitsuhashi, M. (1996) J. Clin. Lab. Anal. 10, 285.

  7. Frackman, S., Kobs, G., Simpson, D. and Storts, D. (1998) Promega Notes 65, 27.

  8. McConlogue, L., Brow, M.A. and Innis, M.A. (1988) Nucl. Acids Res. 16, 9869.

  9. Oshima, R.G. (1992) BioTechniques 13, 188.

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Q.どの耐熱性DNA polymeraseが非鋳型依存的に3’末端にAを付加しますか。

3´→5´ exonuclease活性を欠いた耐熱性DNA Polymeraseは鋳型に依存せずにヌクレオチド(通常はdATP)を増幅産物の3’末端に付加します。このような酵素には、Taq DNA Polymerase、Tfl DNA Polymerase、Tth DNA Polymeraseが含まれます (表 1)。polymeraseが3´→5´ exonuclease proofreading活性を持つ場合、 この活性によって鋳型に依存しないヌクレオチドは除かれ、平滑末端を有する産物となります。これらの酵素にはTli DNA Polymerase、Pfu DNA Polymeraseなどが含まれます。(PN71-Q&A)

表1.耐熱性DNAポリメラーゼの特徴

特徴

Taq DNA Polymerase

Tfl DNA Polymerase

Tth DNA Polymerase

Tli DNA Polymerase

Pfu DNA Polymerase

由来

Thermus Aquaticus

Thermus flavis

Thermus thermophilus HB-8

Thermococcus litoralis

Pyrococcus furiosus

分子量

94kDa

94kDa

94kDa

90kDa

92kDa

半減期(95℃)

40分

40分

20分

400分

伸長率(nt/sec. @72℃)

60~150

※※

25

67

逆転写活性

低レベル

低レベル


(Mn2+依存性)

×

サイクル半減期

50サイクル

50サイクル

25サイクル

500サイクル

3'Aの付加

×

×

5'→3' エクソヌクレアーゼ活性

×

×

3→'5' エクソヌクレアーゼ活性

×

×

×

※データー無  ※※解析中

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Q.鋳型DNAを加えずにPCRを行ってもバンドが出ます。コンタミネーションではないでしょうか?

GoTaqは大腸菌で発現させたリコンビナントTaqです。そのため大腸菌由来のゲノムDNAが精製Taq酵素に残存するケースがございます。これはリコンビナントTaqに共通して起こりえることで、Randam amplified PCRやバクテリア遺伝子の増幅を行う際に問題になることがございます。バクテリア遺伝子の増幅などにご使用の際には、Negative control実験などで十分ご確認ください。

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 RT-PCR

RT-PCR 一般

Q.逆転写反応にはどんな酵素が使えますか。

プロメガではAMV (Avian Myeloblastosis Virus) 逆転写酵素 (Cat.# M5101, M5108, M9004) とM-MLV(Moloney Murine Leukemia Virus) 逆転写酵素 (Cat.# M1701, M1705) の2種類を販売しています。M-MLV RT は 71kDa の単量体タンパク質です(1)。AMV RT は 63kDa のαサブユニットと 92kDa のβサブユニットからなる 155kDa の二量体です(2)。M-MLV RT は AMV RT よりも低い RNase H 活性を示します(3)。このため、M-MLV RT はより長い cDNA (>5kb) の逆転写に適しています。一方、AMV RT は M-MLV RT に比べて非常に高い processivity (一度結合した時に取り込まれるヌクレオチドの数) を示し、さらにより高い反応温度で活性を示します。一般的に、M-MLV RT は 37℃ で使われます。AMV RT は 2 ステップのRT-PCR では通常 42℃ で使われますが、58℃ まで活性が維持されます。このように AMV RT は高温で活性を維持しているため、強固な2次構造を持ったRNAからの逆転写反応に適しています。(PN71-Q&A)

参考文献:

  1. Roth, M.J., Tanese, N. and Goff, S.P. (1985) J. Biol. Chem. 260, 9326.

  2. Grandgenett, D.P., Gerard, G.F. and Green, M. (1973) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70, 230.

  3. Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) In: Molecular Cloning, A Laboratory Manual Vol. 1, Second Edition, 5.52.

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Q.RT-PCRでpoly (A)+ RNAの代わりにTotal RNAを使えますか

cDNAライブラリーの作成を目的としていなければ、RT-PCRの鋳型にpoly(A)+ RNAは必要ありません。1μgのTotal RNAをサンプルとして十分な結果が得られます。poly(A)+ RNAでは、増幅されたmRNAの量により、通常1pgから1μgで十分です。

Total RNAのサンプルでは、高濃度のリボゾーマルRNAとトランスファーRNAが存在するため、ランダムプライマーを用いてcDNAライブラリーを作成することは一般的には推奨しません。しかし、PCRは高感度な増幅が可能なため、ランダムプライマー・oligo(dT) プライマー、目的の遺伝子に特異的なプライマーを用いて、第1鎖cDNAを合成することができます。そのため、プロメガではReverse Transcription System(Cat.# A3500)にランダムプライマーを加えました。(PN71-Q&A)

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Q.Pfu DNA PolymeraseはRT-PCRに使えますか

AMV RTとMMLV RTは共に低い忠実度のDNA polymeraseで、AMVでは17,000塩基に1つ、MMLVでは30,000塩基に1つのエラーが起こり得ます(1、2)。そのため逆転写のときに変異が導入される可能性があります。Pfu DNA Polymeraseが通常RT-PCRに使われないのは、Pfu DNA Polymeraseを使うことで増幅時のエラーは減らすことができますが、逆転写反応の時に導入されたエラーは修正されないためです。(PN71-Q&A)

参考文献:

  1. Roberts, J.D., Bebenek, K. and Kunkel, T.A. (1988) Science 242, 1171.

  2. Roberts, J.D. et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9, 469.

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Q.RT-PCRにおいてRNAの2次構造に関する問題を解決するために有効な方法とは何ですか。

AMV RTはM-MLV RTよりも高い反応温度で活性を示します。このためAMV RTは強固な2次構造を持つ鋳型に対してはより良い選択であると考えられます。AMV RTは58℃まで活性を維持します。しかしながら、50℃以上ではすぐに活性は低下し、長時間の活性維持はできません。高温での逆転写を行う時に考慮することとして、プライマーのアニーリング温度が挙げられます。より高温での反応では42℃を最適のアニーリング温度とするoligo(dT)プライマーを使えない可能性があります。このように高い反応温度下では、目的の遺伝子に特異的なプライマーを使うことが望ましいです。

RNAの構造が問題となるサンプルを扱う場合に用いるべきその他の方法として2~5% DMSOの添加があげられます。DMSOは塩基対を解離させるため、増幅量を増加させることができます(1)。 Sodium pyrophosphate (<=4mM)も、RNAの2次構造や第1鎖 cDNAの収量を増加するための手段として、AMV RTを用いた2段階のRT-PCRのRT反応に添加されます(2)。pyrophosphateは、酵素のDNA伸長反応を遅くさせ、強固なRNAの2次構造による鋳型からの酵素の落下を起こりにくくします。M-MLV RTでは、pyrophosphateへの感受性が増加されているため、使用しないでください(3)。(PN71-Q&A)

参考文献:

  1. Frackman, S. et al. (1998) Promega Notes 65, 27.

  2. Kacian, D.L. and Myers, J.C. (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 2191.

  3. Roth, M.J., Tanese, N. and Goff, S.P. (1985) J. Biol. Chem. 260, 9326.

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Q.RT-PCRの産物をクローニングするためにどのような方法が使えますか。

プロメガでは、鋳型に依存せずに3’末端に1つのdeoxyadenosine(A)が付加された増幅産物のクローニングにpGEMR-T (Cat.# A3600, A3610) と pGEMR-T Easy (Cat.# A1360, A1380) Vector Systemsを販売しています。これらのベクターはPCR産物とのライゲーションが効率的に行われるように3’末端に1つのTが突出した直鎖状DNA分子です。さらに、プロメガではこれらのキットに添付されるバッファーの組成を改良しました。この新しい2X Rapid Ligation Bufferでは、室温1時間でライゲーション反応を行うことができます( 以前の10× Bufferでは4℃一晩)。この2× Rapid Bufferで得られるコロニー数は、以前の10×Bufferを用いて4℃一晩で得られた数と同等でした。(PN71-Q&A)

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Q.RT-PCRのサンプル調製の時、ゲノムDNAを除くためにはどんな方法が最適ですか。

逆転写の反応を行う前に、RNAサンプルをRQ1 RNase-Free DNase (Cat.# M6101) で処理することでゲノムDNAを除きます。DNAを消化した後、DNase IはEGTA(最終濃度2mM)の添加または65℃・10分間の加熱によって不活性化します。第1鎖合成反応も増幅反応も2mM EGTAによって阻害されません。SV Total RNA Isolation System (Cat.# Z3101)を使って単離されたRNAは、SV column membrane上で行うDNase処理が含まれるため、ゲノムDNAの混入はありません。

ゲノムDNAの増幅はイントロンを含むプライマーをデザインすることで多くの場合において回避できます。ゲノムDNAが増幅された場合、その結果として示されたバンドは予想されたcDNAに比べてより大きなバンドとなります(PN71-Q&A)

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Access RT-PCR System

Q.Access RT-PCR Systemで増幅できる最長の配列はどれくらいですか

プロメガではヒト骨格筋から単離したTotal RNAを用いて、dystrophin mRNAから3.9kbの増幅に成功しました(1)。しかし、増幅されうる最長のサイズは目的のmRNAに固有な特性に依存します。RNAの強固な2次構造は、mRNAを全長cDNAに変換する効率を下げることがあるため、増幅する鋳型のサイズが制限されます。(PN71-Q&A)

参考文献:
1.Miller, K. and Storts, D.R. (1996) J. NIH Res. 8, 48.

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Q.oligo(dT)プライマーまたはランダムヘキサマーをAccess RT-PCR Systemで逆転写プライマーとして使うことができますか

できます。Access RT-PCR Systemでoligo(dT)プライマーを使う時には42℃で逆転写します。ランダムヘキサマーを使う時には、はじめに室温で10分間、続けて42℃で15分間インキュベートします。

増幅段階でのアニーリングは50℃以上で行ないます。この条件では、oligo(dT)やランダムヘキサマーのアニーリングは防がれますが、目的の領域を増幅させるためのプライマーはアニーリングできます。目的の領域を増幅させるためのプライマーのTm値は60℃付近に設定します。プロメガのホームページに掲載しているAmplification AssistantSM PCR Troubleshooting Program ( www.promega. com/amplificationasst/ )は、アニーリング温度などの様々なPCRのパラメーターの最適条件を検索するためのオンラインツールです。

Reverse Transcription System (カタログ番号 A3500)ではoligo(dT)プライマーに加え、ランダムヘキサマーも入っているので、PCRの前のcDNA合成にたいへん便利です。(PN70-FAQ)

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Q.Access RT-PCR Systemの逆転写ステップで、目的の遺伝子に特異的なプライマーの代わりにランダムプライマーやoligo(dT)プライマーを使うことができますか

Access RT-PCR Systemを使った反応では、第1鎖cDNA合成のための目的の遺伝子に特異的なプライマーに加えて、1μM oligo(dT)またはランダムプライマーのどちらかを補うことができます。しかし、oligo(dT)プライマーとランダムプライマーはアニーリング温度が低いため、通常推奨される48℃よりも低い温度で行った方が良いかもしれません。たとえば室温で10分間反応させた後、42℃で35分間の反応を行います。この第一段階でプライマーからの伸長が起こるので、42℃に温度を上げたとき、アニーリングの状態は保たれています。一般的に鋳型RNAとプライマーは、室温でアニーリングさせる前に94℃で2分間加熱し、変性させる必要があります。AMV RTは94℃で不活性化されるため、鋳型とプライマーが冷めるまでAMV RTは加えないようにしてください。

oligo(dT)またはランダムプライマーのどちらかが存在している場合でも、遺伝子特異的なプライマーがより高いアニーリング温度である場合は、バックグラウンドのバンドは現れません。例えば、プライマーのデザインが適切で、60~65℃にPCRサイクルのアニーリングステップが設定されている場合、非特異的なプライマーに由来するバックグラウンドのバンドが現れることはありません。(PN71-Q&A)

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Reverse Transcription System

Q.AMV Reverse Transcriptaseに添付されている5× Reaction BufferはReverse Transcription Systemに添付される10× Reverse Transcription Bufferと置き換えて使うことができますか

プロメガのReverse Transcription System(Cat.# A3500)には、Reverse Transcription 10× Bufferが添付されています。このバッファーを用いた逆転写反応液は、PCR反応に使う時に除く必要がありません。一方、AMV Reverse Transcriptaseに添付される5× Reaction Bufferはspermidineを含んでいるため、PCR反応前に除かなければ、その反応を阻害します。(PN71-Q&A)

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