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プロメガ製品 Q & A 【 RealTime-Glo™ MT Cell Viability Assay 】

 

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[発光原理と試薬の保存・性質、他の生存性試験との違い]

Q. どのようなメカニズムで生存細胞を測定しているのですか?

Q.  RealTime-Glo™ MT Cell Viability Assayの特徴は?

Q. 試薬の保存条件教えてください。

Q.  MTTなどの発色法での細胞生存性試験との違いに関して教えてください。

Q. CellTiter-Glo® との違いや使い分けに関して教えてください。

Q. RealTime-Glo試薬を『調製した際』に沈殿物・析出物が観察されます。アッセイに影響はありませんか?取り除く方法はありませんか?

Q. RealTime-Glo試薬を培地に『添加した後に』、細胞培養を続けると顕微鏡下で沈殿物・析出物が観察されます。アッセイに影響はありませんか?

 
[測定機器に関して]

Q. 測定機器は何が必要ですか?

Q. リアルタイムアッセイの際には、インキュベーター機能が付属した検出装置が必要ですか?また、リアルタイムアッセイでの注意点を教えてください。

Q. 発光測定の際に、培養プレートのフタを外さなければなりません。コンタミネーションを防止するにはどのような対策がありますか?

Q. 培養プレートのフタをつけて測定可能な機器の場合、フタを付けたことで測定に影響はありますか?

Q. 推奨の培養プレートを教えてください。

 
[測定に関して]

Q. アッセイ試薬を添加してから、どの段階から測定可能になりますか。また、どのようなタイムコースを取ればよいですか?

Q. エンドポイントアッセイに使用することは可能ですか?

Q. RealTime-Glo™ MT Cell Viability Assayにて、測定できる細胞数は?

Q. バクテリアや酵母にも使用できますか?

Q. 細胞が増加したり、長時間の測定を行うことで基質が枯渇し、シグナルが減衰してしまうことはありませんか。

Q. 発光に影響を与える物質はありますか?

Q. 3次元培養においても、使用できますか?

Q. RealTime-Glo™ MT Cell Viability Assayと他の試薬とのマルチアッセイは可能ですか?

Q. マルチアッセイの際、RealTime-Glo™ MT Cell Viability Assayの発光が、他の試薬での検出に影響を及ぼすことはありませんか?

Q.  RealTime-Glo™ MT Cell Viability Assayを用いて、細胞の増殖を測定しています。発光シグナルがプラトーに達した後に、発光シグナルの減衰が観察されました。どのようなことが原因と考えられますか?

Q. RealTime-Glo試薬を『調製した際』に沈殿物・析出物が観察されます。アッセイに影響はありませんか?取り除く方法はありませんか?

Q. RealTime-Glo試薬を培地に『添加した後に』、細胞培養を続けると顕微鏡下で沈殿物・析出物が観察されます。アッセイに影響はありませんか?

 

発光原理と試薬の保存・性質、他の生存性試験との違い

Q. どのようなメカニズムで生存細胞を測定しているのですか?

A. RealTime-Glo™は、生細胞の還元力より、培養中の生細胞数を測定しています。 このアッセイでは培養細胞にNanoLuc® luciferaseと細胞内に透過するNanoLuc® 基質前駆体を添加します。生細胞は基質前駆体を還元し、NanoLuc® ルシフェラーゼの基質を生成します。
この基質は細胞内から培地に拡散し、NanoLuc® ルシフェラーゼにより迅速に消費され発光シグナルを生じます。この発光シグナルは生細胞数に相関します。
一方で、死細胞では還元力が失われているために、基質が生成されず、発光シグナルは生じません。

RealTime-Glo™ MT Cell Viability Assayの発光原理

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Q. RealTime-Glo™ MT Cell Viability Assayの特徴は?

A. 試薬を培地に添加後、最大72時間は安定です。培地の除去、細胞の洗浄や溶解、その他の試薬を添加なく発光シグナルを検出することができます。また、この試薬は細胞への毒性もありません。このため、同じウェルを長時間にわたってモニタリングすることができます。

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Q. 試薬の保存条件教えてください。

A. NanoLucEnzyme, 1,000X、MT Cell Viability Substrate, 1,000Xは遮光して、-20℃に保存してください。キットに記載されている消費期限まで保管可能です。 試薬を培地に溶かした後は24時間内に使用し、保存は行わないでください。

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Q. MTTなどの発色法での細胞生存性試験との違いに関して教えてください。

A. 従来のMTTなどの比色定量試薬と異なり、試薬を培地に添加するのみですぐに生細胞を測定可能です。また、発光での検出法を生かした低バックグラウンドでの測定が可能です。
その他、検出方法、アッセイ、検出機器などが異なります。詳細は下図をご参照ください。

MTTアッセイ RealTime-Glo™
検出方法 発色 発光
Non-RI
感度 低感度、高バックグラウンド 高感度、低バックグラウンド
アッセイ エンドポイントアッセイ リアルタイムアッセイ、エンドポイントアッセイ両方可能
検出機器 特定のフィルターが必要 フィルター不要
測定までの時間 1~4時間のインキュベーションが必要 リアルタイムアッセイ:試薬添加後から測定可能
エンドポイントアッセイ:10分後から測定可能
原理 生細胞の還元作用によるテトラゾリウム化合物
からホルマザン産物への変換量を測定
生細胞の還元能を、ルシフェラーゼ反応により
生じる発光として測定

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Q. CellTiter-Glo® との共通点や違い、使い分けを教えてください。

A. 従来のCellTiter-Glo® と比べ、試薬を培地に添加するのみで培養しながら測定可能です。そのため、測定用のサンプル調製が不要です。また、RealTime-Glo™ では、経時的な細胞増殖の測定が可能です。
その他、アプリケーション、アッセイ、原理が異なります。詳細は下図をご参照ください

CellTiter-Glo® 、CellTiter-Glo® 2.0 RealTime-Glo™
検出方法 発光(ホタルルシフェラーゼ) 発光(NanoLuc ルシフェラーゼ)
感度 高感度、低バックグラウンド 高感度、低バックグラウンド
アプリケーション 単層培養細胞 単層培養細胞および、3次元培養細胞
アッセイ エンドポイントアッセイのみ リアルタイムアッセイ、エンドポイントアッセイ
両方可能
細胞溶解 不要
測定装置 フィルター不要 フィルター不要
測定までの時間 試薬添加して10分後から測定可能 リアルタイムアッセイ:試薬添加後から測定可能
エンドポイントアッセイ:10分後から測定可能
原理 生細胞由来のATPを、ルシフェラーゼ反応により
生じる発光として測定
生細胞由来の還元能を、ルシフェラーゼ反応により
生じる発光として測定

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Q. RealTime-Glo試薬を『調製した際』に沈殿物・析出物が観察されます。アッセイに影響はありませんか?取り除く方法はありませんか?

A. アッセイに影響がないことや、細胞に対して毒性は示さないことを確認しています。
フィルトレーションにより、沈殿物・析出物を除くことができます。
弊社では下記のフィルターでの検討を行っており、発光シグナルやアッセイ時間に影響なくフィルトレーションができています。

  • Millipore; マイレクス(Millex-LG, 0.20 µm, 親水性, PTFE, 25 mm, エチレンオキサイド滅菌済(型番:SLLG025SS)
  • Corning® ; 25mm Diameter Syringe Filters, 0.45µm Pore NY Membrane, Sterile(型番:431225)
  • Nalgene™; Syringe Filter with Cellulose Acetate Membrane Filter, Sterile, Diameter: 25mm, Pore Size: 0.8µm(型番: 190-2580)
  • Sartorius; Minisart® NY25シリンジフィルター(型番:17845)

また、フィルトレーション方法は、RealTime-Gloアッセイのマニュアル(http://www.promega.jp/resources/protocols/technical-manuals/101/realtimeglo-mt-cell-viability-assay-protocol/)をご覧ください。

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Q. RealTime-Glo試薬を培地に『添加した後に』、細胞培養を続けると顕微鏡下で沈殿物・析出物が観察されます。アッセイに影響はありませんか?

A. アッセイに影響がないことや、細胞に対して毒性は示さないことを確認しています。 この析出物は細胞内で代謝されたRealTime-Glo基質代謝物に由来します。RealTime-Glo基質代謝物は代謝前より沈殿を生じやすい性質をもち、アッセイにおいて細胞数が多すぎる場合や、少ない細胞数で長期のアッセイを行っているときに発生することが確認されています。
アッセイの条件を見直すことで解消できる可能性がございますので、使用する細胞数等をご検討ください。

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測定機器

Q. 測定機器は何が必要ですか?

A. ルミノメーターもしくは、発光が測定可能なプレートリーダーなどで測定可能です。

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Q. リアルタイムアッセイの際には、インキュベーター機能が付属した検出装置が必要ですか?また、リアルタイムアッセイでの注意点を教えてください。

A. インキュベーター機能が付属していない検出装置でも測定出可能です。培養プレートを測定ごとに、インキュベーターから検出装置に移してください。
ただし、インキュベーターからの出し入れによる温度の変化は、細胞の状態や発光値に影響を与えます。検出装置に温度コントロール機能が付いていない場合には、 素早く測定に移るか、培養プレートを室温に戻してから測定を行ってください。

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Q. 発光測定の際に、培養プレートのフタを外さなければなりません。コンタミネーションを防止するにはどのような対策がありますか?

A. コンタミネーション対策として、培地への抗生物質の添加やPCR用のプレートシール等を一時的にプレートに貼り付けることによりコンタミネーションを防ぐことができます。

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Q. 培養プレートのフタをつけて測定可能な機器の場合、フタを付けることで測定に影響はありますか?

A. フタをつけて測定可能な機器の場合、フタを付けて測定することは可能です。ただし、測定機器によりますが、クロストークが起きてしまうことがありますのでご注意ください。

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Q. 推奨の培養プレートを教えてください。

A. 市販の細胞培養可能な白ソリッドプレートまたはクリアボトムプレートであれば、測定可能です。
下記に一例を示します。

メーカー タイプ カタログ番号の一例 特徴
コーニング・コースター クリアボトム 3610 滅菌済/フタあり
ナルジェ・ヌンク クリアボトム
(オプティカルボトム)
165306 滅菌済/フタあり
パーキンエルマー クリアボトム(ViewPlate® 6005181 滅菌済/フタあり

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測定に関して

Q. アッセイ試薬を添加してから、どの段階から測定可能になりますか。また、どのようなタイムコースを取ればよいですか。

A. アッセイ試薬を添加して、一定時間後に測定可能となります。タイムコースに関しては、下図のように自由に設定できます。

A)細胞播種時の培地に試薬を添加し、細胞播種と同時に測定
(リアルタイム-0ステップアッセイ)
B)細胞播種後に、試薬とテスト試薬を添加し、経時的観察
(リアルタイム-1ステップアッセイ)

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Q. エンドポイントアッセイに使用することは可能ですか。

A. エンドポイントアッセイに使用することもできます。下図のようにテスト試薬を細胞に添加した後に、2X RealTime-Glo™ MT Cell Viability Assay試薬を含む培地を添加し、生存細胞数を測定します。


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Q. RealTime-Glo™ MT Cell Viability Assayにて、測定できる細胞数は?

A. RealTime-Glo™の発光シグナルは細胞の持つ還元能に影響を受けます。このため、あらかじめ予備実験を行い、測定可能な細胞数の検討を行ってください。

下記の細胞で検討を行っています(384well plate)

  • PC3: 500 cells/well
  • Jurkat: 3,000 cells/well
  • A549: 250 cells/well
  • HepG2: 300 cells/well
  • MDA-MB-231: 5,000 cells/well
  • HeLa: 300 cells/well
  • HCT116: 1,500 cells/well
  • MCF7: 500 cells/well

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Q. バクテリアや酵母にも使用できますか?

A. バクテリア、酵母、菌類にも使用できます。
下記は測定例のあるバクテリアです。

  • E. coli (Gram-)
  • B. cereus (Gram+)
  • P. aeruginosa (Gram-)
  • S. aureus (Gram+)

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Q. 細胞が増加したり、長時間の測定を行うことで基質が枯渇し、シグナルが減衰してしまうことはありませんか。

A. RealTime-Glo™ の試薬には十分量の基質が含まれています。多くの細胞種において、72時間以内では基質の枯渇によるシグナル減衰は無いデザインとなっています。
しかし、実験条件や特殊な細胞種においては、基質の消費が早く、72時間内に消費されてしまう報告もあります。

RealTime-Glo™ MT Cell Viability Assayマニュアル, Fig3を参考に、予備検討を行い、72時間までの連続測定が出来るかどうかご確認された後に、本実験を実施してください。

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Q. 発光に影響を与える物質はありますか?

A. 1% を超えるDMSOが培地に含まれていると、発光に影響を及ぼすことが報告されています。また、培地に還元剤が含まれていると、基質前駆体が細胞非依存的に還元されてしまい、バックグラウンドの原因となります。
下記の還元剤を含む条件での検討を行っており、高濃度の条件下で細胞非依存的な発光が生じることがわかっています。

  • DTT
  • TCEP
  • sodium sulfite
  • β-mercaptoethanol

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Q. 3次元培養においても、RealTime-Glo™ MT Cell Viability Assayは使えますか。

A. はい、使用できます。hanging-drop法などでspheroidを形成させたサンプルにおいて、測定可能であることを確認しています。直径500μmのサンプルまで測定可能です。

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Q. 他の試薬とのマルチアッセイは可能ですか。

A. はい、可能です。
下記は、組み合わせが可能なアッセイ例になります。

1st アッセイ 2nd アッセイ 得られる情報
RealTime-Glo™ MT Cell Viability Assay CellTox™ Green Cytotoxicity Assay 細胞生存性と細胞毒性
CytoTox-Fluor™ Cytotoxicity Assay 細胞生存性と細胞毒性
CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay 2つの細胞生存性マーカー(還元能とATP)
ROS-Glo™ H2O2 Assay 細胞生存性と細胞内H2O2の測定
NAD/NADH-Glo™ Assay 細胞生存性と細胞内NAD+/NADHの測定
NADP/NADPH-Glo™ Assay 細胞生存性と細胞内NADP+/NADPHの測定
Reporter assays(ONE-Glo Luciferase Assay Systemなど) 細胞生存性とレポーターアッセイ
RNA isolation 細胞生存性とRNA分析

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Q. マルチアッセイの際、RealTime-Glo™ MT Cell Viability Assayの発光が、他の試薬での検出に影響を及ぼすことはありませんか?

A. RealTime-Glo™ の発光は蓄積するタイプの発光ではありません。細胞が死滅し、生細胞の還元能が失われると2分以内に消光するというデータがあります(下図)。このため、次のアッセイに影響を及ぼしません。


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Q. RealTime-Glo™ MT Cell Viability Assayを用いて、細胞の増殖を測定しています。発光シグナルがプラトーに達した後に、発光シグナルの減衰が観察されました。どのようなことが原因と考えられますか?

A. 細胞がコンフルエントに達したことにより代謝が変化した可能性および、培養環境の悪化で一部に細胞死が起きている可能性があります。測定可能な細胞数を超えてしまっていますので、適切な細胞数にて測定ください。

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Q. RealTime-Glo試薬を『調製した際』に沈殿物・析出物が観察されます。アッセイに影響はありませんか?取り除く方法はありませんか?

A. アッセイに影響がないことや、細胞に対して毒性は示さないことを確認しています。
フィルトレーションにより、沈殿物・析出物を除くことができます。
弊社では下記のフィルターでの検討を行っており、発光シグナルやアッセイ時間に影響なくフィルトレーションができています。

  • Millipore; マイレクス(Millex-LG, 0.20 µm, 親水性, PTFE, 25 mm, エチレンオキサイド滅菌済(型番:SLLG025SS)
  • Corning® ; 25mm Diameter Syringe Filters, 0.45µm Pore NY Membrane, Sterile(型番:431225)
  • Nalgene™; Syringe Filter with Cellulose Acetate Membrane Filter, Sterile, Diameter: 25mm, Pore Size: 0.8µm(型番: 190-2580)
  • Sartorius; Minisart® NY25シリンジフィルター(型番:17845)

また、フィルトレーション方法は、RealTime-Gloアッセイのマニュアル(http://www.promega.jp/resources/protocols/technical-manuals/101/realtimeglo-mt-cell-viability-assay-protocol/)をご覧ください。

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Q. RealTime-Glo試薬を培地に『添加した後に』、細胞培養を続けると顕微鏡下で沈殿物・析出物が観察されます。アッセイに影響はありませんか?

A. アッセイに影響がないことや、細胞に対して毒性は示さないことを確認しています。
この析出物は細胞内で代謝されたRealTime-Glo基質代謝物に由来します。RealTime-Glo基質代謝物は代謝前より沈殿を生じやすい性質をもち、アッセイにおいて細胞数が多すぎる場合や、少ない細胞数で長期のアッセイを行っているときに発生することが確認されています。 アッセイの条件を見直すことで解消できる可能性がございますので、使用する細胞数等をご検討ください。

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