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プロメガ製品 Q & A 【 レポーターアッセイ① 】

 

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【NanoLuc™】

Q. NanoLuc™の由来は何ですか?

Q. NanoLuc™は他のルシフェラーゼと比べ、どのくらい明るいのですか?

Q. NanoLuc™の細胞内での安定性に関するデータはありますか?

Q. NanoLuc™は哺乳動物細胞以外でも使えますか?

Q. NanoLuc™の抗体はありますか?

Q. NanoLuc™と任意のタンパク質を融合させて使用することは可能ですか?


【Nano-Glo®

Q. 保存条件を教えてください

Q. 発光波長を教えてください

Q. Nano-Glo®の発光半減期はどの程度ですか?

Q. 細胞ライセートを作ってアッセイできますか?

Q. Nano-Glo®はデュアルレポーター方式に対応していますか?

Q. NanoLuc™基質 furimazineおよびin vivo用の基質は販売していますか?

Q. 細胞イメージングなどでNanoLuc基質を使用する方法を教えてください。


【pNL Vector】

Q. pNL Vectorの特徴を教えてください

Q. 分泌型アッセイのメリットは何ですか?

Q. pNL ベクターはpGL4ベクターとどのように違うのですか?

Q. 配列情報を教えてください

Q. いろいろなベクターがあるようですが、どのように使い分けたらいいですか?

Q. minPとは、何ですか?


NanoLuc™

Q. NanoLuc™の由来は何ですか?

NanoLuc™(Nluc)はトゲオキヒオドシエビ(Oplophorus gracilirostris)由来のルシフェラーゼです。発光レポーターとして最適なパフォーマンスを発揮するために改変された発光酵素です。

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Q. NanoLuc™は他のルシフェラーゼと比べ、どのくらい明るいのですか?

各種ルシフェラーゼ精製酵素を用いた実験より、ホタル、ウミシイタケルシフェラーゼと比較して発光値が150倍以上高いことを確認しております。以下の比較図をご参照ください。

  

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Q. NanoLuc™の細胞内での安定性に関するデータはありますか?

下記の細胞種で検討した結果、細胞内で6時間以上のタンパク質半減期を持つことを確認しております

Fluc-PおよびNluc-Pはタンパク質分解配列PESTを付加し、応答性を向上させるためのベクターです。
詳細は下記をご覧ください。
http://www.promega.co.jp/jp/jp_tech/FAQs/Q&A_Reporter.htm#pGL4_08

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Q. NanoLuc™は哺乳動物細胞以外でも使えますか?

NanoLuc™は哺乳動物細胞の他に、植物細胞、大腸菌で正常に発現することを確認しています。ただし、その発現にはそれぞれの生物種に応じた発現ベクターにNanoLuc™のORFを乗せ換える必要があります。

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Q. NanoLuc™の抗体はありますか?

NanoLuc™ 抗体の販売は2013年2月現在ありません。

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Q. NanoLuc™と任意のタンパク質を融合させて使用することは可能ですか?

可能です。社内検討実験の例として、アミノ酸配列GGSGGGGSGGGSSGGをリンカーとした融合タンパク質を用いた実験を行っています。

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Nano-Glo®

Q. 保存条件を教えてください

混合前の試薬、Nano-Glo® Luciferase Assay SubstrateおよびNano-Glo® Luciferase Assay Bufferは-20℃保存です。この2つを混合したNano-Glo® Luciferase Assay Reagentは、用事調製することをお勧めします。調製後のNano-Glo® Luciferase Assay Reagentは室温では8時間で10%、48時間で50%活性が低下します。4℃で保存した場合、48時間の活性低下は10%未満です。

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Q. 発光波長を教えてください

NanoLuc™の発光極大波長は460 nmです。以下の各種ルシフェラーゼの発光スペクトルデータをご参照ください。

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Q. Nano-Glo®の発光半減期はどの程度ですか?

発光半減期は、2時間以上です。以下のHEK 293細胞を用いたデータをご参照ください。

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Q. 細胞ライセートを作ってアッセイできますか?

可能です。プロメガの各種細胞溶解剤で作製したライセートに対して、等量のNano-Glo® Luciferase Assay Reagentを添加し、測定することができます。

96ウェルプレートでの実験例

  1. ウェルから培地を除き、PBSで洗浄する。
  2. PBSを除き、Glo Lysis Buffer (GLB)(カタログ番号:E2661)を100μl加える。
  3. 室温で5分間インキュベートする。
  4. 作製したライセート100μlを測定用チューブまたはプレートに移す。※1
  5. 等量100μlのNano-Glo® Luciferase Assay Reagentを添加し、緩やかに混合する。
  6. 3 分間インキュベートする。
  7. ルミノメーターで発光値を測定する。

※1:移す量は必要に応じて変えることができます。

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Q. Nano-Glo®はデュアルレポーター方式に対応していますか?

デュアルレポーター方式に対応した試薬は2012年12月現在販売しておりません。ただし、プロメガの各種細胞溶解剤で作製した細胞サンプルを用いたアッセイは可能です。 試験用にNanoLuc™ベクターを、内部標準用にホタルルシフェラーゼベクターを細胞に導入し、得られた細胞ライセートの一部をNano-Glo®およびホタルシフェラーゼのアッセイ試薬(ONE-Glo™など)で個別に測定することが可能です(下記実験例参照)。 また、ウミシイタケルシフェラーゼはNanoLuc™基質 furimazineに対して交差性がありますので、デュアルレポーター方式での使用はできません。

96ウェルプレートでの実験例(Nano-Glo®およびONE-Glo™を使用)

  1. Nano-Glo® Luciferase Assay ReagentおよびONE-Glo™ Luciferase Assay Reagentを作製し、室温にする。
  2. ウェルから培地を除き、PBSで洗浄する。
  3. PBSを除き、Glo Lysis Buffer (GLB)(カタログ番号:E2661)を100μl加える。
  4. 室温で5分間インキュベートする。
  5. ライセート100μlのうち、Nano-Glo®およびONE-Glo™用に40μlずつ測定用チューブまたはプレートに分注する。※分注量は必要に応じて変えることができます。
  6. Nano-Glo®用のライセートに等量40μlのNano-Glo® Luciferase Assay Reagentを加え、3分間インキュベートした後、発光測定する。
  7. ONE-Glo™用のライセートに等量40μlのONE--Glo™ Luciferase Assay Reagentを加え、3分間インキュベートした後、発光測定する。

内部標準用のホタルルシフェラーゼベクターにはpGL4.13[luc2/SV40] Vector(カタログ番号:E6681)をご使用頂けます。 またはウミシイタケルシフェラーゼのpGL4.74[hRluc/TK] (カタログ番号:E6921)VectorのHSV-TK promoter領域(制限酵素KpnI-Hindlllサイトで切り出し可能)をホタルルシフェラーゼのpGL4.10[luc2] Vector(カタログ番号:E6651)のマルチクローニングサイトに挿入して使用することも可能です。

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Q. NanoLuc™基質 furimazineおよびin vivo用の基質は販売していますか?

NanoLuc™基質 furimazineの単品販売およびin vivo用の基質の販売は2012年12月現在行っておりません。

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Q. 細胞イメージングなどでNanoLuc基質を使用する方法を教えてください。

イメージングなど、細胞を溶解しないで使用する場合は、NanoLuc基質原液を血清不含培地で希釈し、終濃度1/250-1/500になるよう添加してご使用頂けます。Nano-Glo® Luciferase Assay System (N1110)の構成品Nano-Glo® Luciferase Assay Substrateが基質原液です。

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pNL Vector

Q. pNL Vectorの特徴を教えてください

レポーターアッセイの用途により、様々な構成のNanoLuc™ 遺伝子をご用意しております。

●Nluc標準型は長時間、高い発光値を求める場合使用します。細胞内でのタンパク質半減期は6 時間以上です。
●NlucPはPEST タンパク質不安定化ドメインが付加されているため、迅速で応答性の高いレポーター実験が可能です(下図参照)。細胞内でのタンパク質半減期は約10-30分です。



●secNlucは分泌型Nlucで、細胞外へNlucを分泌します。同一ウェルでのタイムコース実験などに使用します。培地中でのタンパク質半減期は4 日以上です。

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Q. 分泌型アッセイのメリットは何ですか?

培地中に分泌されたNanoLuc™は細胞を破壊することなく測定することができます。単位時間ごとに培養上清をサンプリングして測定することにより、同一ウェルでレポーターの経時的な変化を見ることが可能です。

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Q. pNL ベクターはpGL4ベクターとどのように違うのですか?

pNL ベクターシリーズは pGL4 の基本骨格を用いており(pGL4ベクターの特長)、ルシフェラーゼ遺伝子の部分のみが異なります。この基本骨格は数多くの転写因子結合サイトやその他の潜在的な調節エレメントを除去することにより変則的な発現を低減するようデザインされています。Nluc 遺伝子はコドンの最適化が行われ、多くの潜在的な調節エレメント、その他の不要な配列(例:一般的な制限酵素サイト)が除かれています。また、マルチクローニングサイトはpGL4ベクターと同じですので、既存のpGL4 ベクターからのサブクローニングが容易です。以下のベクターマップをご参照ください。

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Q. 配列情報を教えてください

下記サイトにて配列情報を公開しております。
ベクターシークエンス&ベクターマップ
http://www.promega.jp/resources/vector-sequences/

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Q. いろいろなベクターがあるようですが、どのように使い分けたらいいですか?

各pNL ベクターの用途:
pNL 1.x.: プロモーター領域のクローニング
pNL 2.x.: プロモーター領域のクローニング+ 安定細胞株の構築(ハイグロマイシン耐性遺伝子を含むベクター)
pNL 3.x.: 応答エレメントや結合サイトのクローニング(最小プロモーター(minP)を含むベクター)
pNL1.1.CMV, pNL1.3.CMV:標準型および分泌型Nluc用のコントロールプラスミド
以下のpNL ベクター一覧表をご参照ください。
各種NanoLuc™ 遺伝子の使い分けにつきましては「・pNL Vectorの特徴を教えてください」をご覧ください。

Plasmid Reporter Marker Promoter MCS Catalog#
pNL1.1 Nluc - - Y N1001
pNL1.2 NlucP - - Y N1011
pNL1.3 secNluc - - Y N1021
pNL2.1 Nluc Hygro - Y N1061
pNL2.2 NlucP Hygro - Y N1071
pNL2.3 secNluc Hygro - Y N1081
pNL3.1 Nluc - minP Y N1031
pNL3.2 NlucP - minP Y N1041
pNL3.3 secNluc - minP Y N1051
pNL1.1.CMV Nluc - CMV N N1091
pNL1.3.CMV secNluc - CMV N N1101
pNL3.2.NF-kB-RE NlucP Hygro NF-kB-RE/minP N N1111

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Q. minPとは、何ですか?

minPとは、遺伝子の転写開始に必要なTATA boxを含む最小プロモーター(minimal promoter)のことです。 詳細は以下をご覧ください。
Q. minPとは、何ですか?

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