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プロメガ製品 Q & A 【 レポーターアッセイ③ 】

 

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【β-ガラクトシダーゼ定量システム】

Q. β-Galactosidase Assay Systemとは何ですか。

Q. Beta-Glo® Assay Systemはどのような試薬ですか?

Q. Beta-Glo® Assay Systemの特長は何ですか?

Q. Beta-Glo® Assay Systemの保存条件と溶解後の保存期間について教えてください。

Q. Beta-Glo® Assay Systemで得られる発光はどのぐらい安定ですか?

Q. Beta-Glo® Assay Systemの測定で推奨するプレートは何ですか?

Q. Beta-Glo® Assay Systemで使用可能な培地の種類を教えてください。

Q. 培地中のフェノールレッドの影響はありますか? また、アッセイに影響する要因として注意する点はありますか?

Q. Beta-Glo® Assay Systemは酵母でのアッセイに利用できますか?


【GFPレポーターベクター】

Q. Monster Green Fluorescent Protein phMGFP Vector の特長は何ですか?

Q. Monster Green™ Fluorescent Proteinは他の一般的なGFPとどのように異なりますか?

Q. Monster Green™ Fluorescent Proteinとの融合タンパク質を作成することはできますか?

Q. phMGFP Vectorで安定的な発現細胞株を作製することは可能でしょうか?

Q. in vitro 発現系でMonster Green™ Fluorescent Proteinを使用することはできますか?


【CAT定量システム】

Q. pCAT3 Reporter VectorはpCAT Reporter Vectorとどのような違いがありますか。


【細胞溶解剤】

Q. プロメガのルシフェラーゼ試験で使用できる細胞溶解剤の種類とそれらの違いは何ですか?

Q. プロメガの細胞溶解剤では、どのようなレポーターアッセイやタンパク質測定法が行えますか?


 β-ガラクトシダーゼ定量システム

β-Galactosidase Enzyme Assay System

Q. β-Galactosidase Assay Systemとは何ですか。

β-Galactosidase Assay Systemは、β-ガラクトシダーゼを発現するベクター(たとえばpSV-β-Galactosidase Control Vector)でトランスフェクトされた細胞の、β-ガラクトシダーゼの酵素活性を測る、比色法によるアッセイシステムです。pSV-β-Galactosidase Control Vectorは、哺乳類細胞に共トランスフェクトされたときに、トランスフェクション効率をみるための内部標準として使えるよう設計されています。同量の細胞抽出液と基質ONPG(o-nitrophyl-β-D-galactopyranoside)を含むAssay 2×Bufferを混和し、インキュベートします。β-ガラクトシダーゼは無色の基質を黄色のo-nitrophenolに加水分解します。この反応は炭酸ナトリウムで抑制されます。分光光度計またはプレート・リーダーを用いて420nmで光学濃度を測定できます。

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Beta-Glo® Assay System

Q. Beta-Glo® Assay Systemはどのような試薬ですか?

Beta-Glo® Assay Systemは哺乳類培養細胞におけるβ-ガラクトシダーゼの発現量を発光により定量するためのキットです。培地中に”加えて、測定するだけ“のホモジニアスタイプの試薬のため、ハイスループットにも対応できます。

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Q. Beta-Glo® Assay Systemの特長は何ですか?

  • 簡単 : 1種類の試薬を”加えて、測定するだけ“のホモジニアスアッセイキットです。
  • 便利 : 室温で反応を行うので、インキュベーターは不要です。
  • 高感度 : 100fg~1ngのβ-ガラクトシダーゼに対して直線性を示すことができます。
            ONPGによる発色法に比べて約100倍の感度を示します。
  • 長時間発光 :発光は一般的に4時間後まで測定できます。( 試薬を添加してから30分後に測定できます。)

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Q. Beta-Glo® Assay Systemの保存条件と溶解後の保存期間について教えてください。

溶解前のBeta-Glo® SubstrateとBeta-Glo Bufferは-20℃保存で、購入時より6ヶ月安定です。Beta-Glo™ Substrateは暗所に保存してください。
溶解後のBeta-Glo™ Assay Reagentは、22℃で2日保存により20%、4℃または-20℃で7日保存により10%以下の活性低下が見られます。また、3回の凍結/融解により10%の活性の低下が見られます。

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Q. Beta-Glo® Assay Systemで得られる発光はどのぐらい安定ですか?

Beta-Glo® Assayは安定した発光シグナルを示し、試薬の添加後4時間まで測定可能です。30分間のインキュベーションは、発光シグナルを安定させるために必要です。試薬添加後の30~60分の間に、発光シグナルは10分ごとに20%程度減少します。試薬添加後、60分以降の発光シグナルは、一般的に1時間ごとに10%程度の減衰になり、これが4時間まで継続されます。

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Q. Beta-Glo® Assay Systemの測定で推奨するプレートは何ですか?

プレートは、白色不透明タイプをお使いください。また、測定方法により、ソリッドプレートかクリアボトムプレートを選択してください。詳細はこちらをご覧ください。

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Q. Beta-Glo® Assay Systemで使用可能な培地の種類を教えてください。

Beta-Glo® Assay Systemは、10%以下の血清を含む次の培地で試験済みです: RPMI 1640、MEMα、DMEM、Ham’s F12。他の培地や血清の濃度に関しましては、発光の性状(例えば、発光強度、発光の半減期、バックグラウンド)が変わる恐れがありますので、予備実験の実施をお薦めします。

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Q. 培地中のフェノールレッドの影響はありますか? また、アッセイに影響する要因として注意する点はありますか?

培地中における0.5%のフェノールレッドの存在により、発光量が約50%に減少します。また、1% DMSOの存在は、一般的に10%未満の発光量の減少を引き起こします。最良の結果を得るためには、サンプル中のフェノールレッドや有機溶媒の量をできる限り抑えることをお勧めします。その他、発光量は温度変化の影響も受けます。

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Q. Beta-Glo® Assay Systemは酵母でのアッセイに利用できますか?

利用できます。酵母の細胞数により次のような直線性を示します。このようにBeta-Glo® Assayでは、酵母におけるβ-galactosidaseの発現量を定量的な検出が可能なため、Yeast Two-Hybrid Assayでの高感度な検出試薬としてご利用いただけます。プロメガでは、動物細胞を利用したCheckMate™ Mammalian Two-Hybrid System (カタログ番号:E2440)を販売しております。この製品では動物細胞でツーハイブリッドを行うので、擬陽性を抑え、ルシフェラーゼにより高感度な検出が行えます。

β-ガラクトシダーゼを発現したS. cerevisiae strain AH109をSD最少培地(ロイシンマイナス)またはYPDA培地で培養しました。
HP : SD培地で培養し、OD測定後に、酵母を回収して25 mM HEPES(pH 7.5), 0.1% BSAに懸濁しました。

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 GFPレポーターベクター

Monster Green Fluorescent Protein phMGFP Vector

Q. Monster Green Fluorescent Protein phMGFP Vector の特長は何ですか?

Monster Green™ Fluorescent Proteinは、Montastraea cavernosa ( Great Star Coral) からクローニングされ、人工的に改良を加えたGFP (Green Fluorescent Protein ) です。改良型遺伝子 (hMGFP) は、ネイティブ型(MGFP)にくらべ強い蛍光強度を示します。また、hMGFPは、哺乳細胞のコドンの最適化を行い、ほとんどの転写因子結合サイト共通配列除去が行われているため、信頼性のある高レベルの発現を実現します。

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Q. Monster Green™ Fluorescent Proteinは他の一般的なGFPとどのように異なりますか?

Monster Green™ Fluorescent Proteinは、他社より発売されている一般的なGFPに対して少なくとも20%のより明るい蛍光を示します。さらに、phMGFP VectorをCHO cellsやNIH3T3 cellsにトランスフェクションした後、強い蛍光が6-7日間にわたって検出できます。このことはMonster Green™ Proteinの発現が一般的に市販されているGFPに対して毒性が低いことを表します。Monster Green™ Fluorescent Proteinのスペクトラの特性は他のGFPと比較して若干赤色側にシフトしています。蛍光波長のピークは515nmです。
Monster Green™ Fluorescent Protein phMGFP Vectorのスペクトラはこちらをご参照ください。

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Q. Monster Green™ Fluorescent Proteinとの融合タンパク質を作成することはできますか?

可能です。クローニングのための利便性を考慮してphMGFP Vectorには多くの制限酵素部位を配置しています。N末端側に目的タンパク質を融合させる場合は、SmaIまたはEcoRVの部位が利用できます。C末端側に目的タンパク質を融合させる場合は、hMGFPのオープンリーディングフレームの終止コドンの直前に配置されているNaeIの部位が利用できます。
これらの制限酵素部位は消化した時にhMGFPのフレームを保存した平滑末端を生成します。

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Q. phMGFP Vectorで安定的な発現細胞株を作製することは可能でしょうか?

安定的な発現をする細胞を構築するためにはphMGFP Vectorとともに選択マーカーを含むベクターをコトランスフェクションしなければなりません。また、hMGFP遺伝子はNheIとNotIで簡単に切り出すことができますので、pCI-neo Vector (カタログ番号:E1841)のような哺乳類動物の培養細胞の発現ベクターにクローニングできます。pCI-neo Vectorをトランスフェクションした細胞における安定的な発現は、Antibiotic G418 Sulfate (カタログ番号:V7981)により選択できます。

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Q. in vitro 発現系でMonster Green™ Fluorescent Proteinを使用することはできますか?

phMGFP VectorはT7 RNA polymerase promoterをhMGFP遺伝子のすぐ上流に配置しています。このプロモーターはT7 RNA Polymerase (カタログ番号:P2075)を使ったin vitroのRNA合成に利用できます。また、E. coli T7 S30 Extract System for Circular DNA (カタログ番号:L1130)やTNT® T7 Coupled Wheat Germ Extract System (カタログ番号:L4140)を使ったin vitroのタンパク質合成に利用できます。ただし、ウサギ網状赤血球ライセートは、内在するヘモグロビンが高い吸光特性を示し、GFP蛍光タンパク質の検出を阻害するため、お勧めできません。

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 CAT定量システム

CAT Enzyme Assay System

Q. pCAT3 Reporter VectorはpCAT Reporter Vectorとどのような違いがありますか。

pCAT3 Vectorを作製するために、pCAT Vectorは主に9つの修飾がなされました。

  1. 発現を増加させ、予期せぬスプライシングを減らすために、SV40 small T antigen intronがCAT遺伝子のキメリック・イントロン5'に置き換えられました。
  2. 転写終結とポリアデニル化効率をあげるためにCATのpoly(A)シグナルがearly SV40 poly(A) シグナルからlate SV40 poly(A) シグナルに変更されました。
  3. CAT遺伝子上流の擬似の転写を終結させるために、poly(A)および転写停止サイトがCAT遺伝子とMCSの5'側に挿入されました。
  4. 翻訳効率を最適化するためにコザック・コンセンサス・シークエンスがCAT遺伝子の5'末端に作製されました。
  5. MCSがpGL3 Vectorと互換を持つように変更されました。
  6. 1本鎖DNAの作製のためにf1 oriがベクターに挿入されました。
  7. サブクローニングを容易にするために単一のNco Iサイトがコザック・シークエンス中に作製されました。
  8. 単一のXba IサイトがCAT遺伝子のすぐ下流に作製されました。
  9. EcoR IサイトがCAT遺伝子から除去され、アミノ酸がPhe73からLeu73に変わりました。

これらの修飾は、トランスフェクトされた細胞でCATの発現を増加させ、クローニングの自由度を高めます。
詳しくはpCAT3 Reporter Vectors Technical Manual #TM036をご覧ください。

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 細胞溶解剤

細胞溶解剤

Q. プロメガのルシフェラーゼ試験で使用できる細胞溶解剤の種類とそれらの違いは何ですか?

プロメガのルシフェラーゼ試験では、Cell Culture Lysis Reagent (CCLR)(カタログ番号:E1531)、Reporter Lysis Buffer (RLB)(カタログ番号:E3971)、Passive Lysis Buffer (PLB)(カタログ番号:E1941)、Glo Lysis Buffer(GLB) (カタログ番号:E2661)の4種類の細胞溶解液が利用できます。それぞれの細胞溶解液は、使用法や特徴が異なります。それを以下に示します。

CCLRは、Luciferase Assay Systemで効果的な細胞溶解ができるように、また高いシグナルと低いバックグラウンドが得られるように調製されています。このバッファーは、β-ガラクトシダーゼやCATなど、ほかのレポーター遺伝子のアッセイには対応していません。また、プロメガのDual-Luciferase® Reporter (DLR) Assay System(カタログ番号:E1910)などのウミシイタケ・ルシフェラーゼのアッセイにも対応していません。CCLRに含まれる、高濃度の界面活性剤やDTTが一般的なタンパク質定量を難しくします。しかし、アッセイの前に細胞溶解液を2倍以上水で希釈すれば、界面活性剤対応のタンパク質定量法を使うことができます。

RLBは、同じ細胞溶解液でルシフェラーゼ、CAT、およびβ-ガラクトシダーゼ・レポーター・アッセイができるように特別に調製されています。この溶解液は、CCLRと比べると細胞の溶解では効率が落ちるので、細胞を完全に壊すために機械的な破壊や凍結融解を必要とします。タンパク質の濃度は界面活性剤対応のタンパク質定量法により定量できます。CCLRと同様にRLBもDual-Luciferase® Reporter Assay Systemを含むウミシイタケルシフェラーゼのアッセイには対応していません。

PLBは、Dual-Luciferase® Reporter Assay Systemを使う場合に、ホタルおよびウミシイタケ・ルシフェラーゼ・アッセイで高いシグナルと低いバックグラウンドが得られるよう、特別に調製されています。この細胞溶解液は、CATやβ-ガラクトシダーゼ・レポーター・アッセイにも対応しています。PLBは、強力な溶解液なので、通常、細胞を完全に溶解するためにほかの操作を加える必要はありません。界面活性剤適応のタンパク質定量法を用いることによりPLB中でタンパク質の濃度を定量できます。

GLBは、強力で細胞の掻取りや凍結/融解操作が不要です。バッファーを添加するだけで、通常5分以内に細胞を溶解することができます。特にグロータイプ(長時間発光)のBright-Glo™(>30分間)とSteady-Glo®(>5時間)用に開発されており、発光時間に影響を与えないため、どちらに使用しても半減期は変化しません。どちらのルシフェラーゼ定量試薬もホモジニアスアッセイ方式を採用していますが、このバッファーの使用により従来のノン-ホモジニアスアッセイ(培養細胞全体を溶解して、その一部をアッセイに使用する方法)にも使用できます。また、酵素の安定性に優れ、ホタルルシフェラーゼの場合、室温で少なくとも48時間は安定です(1mg/ml BSAを含む1XGlo Lysis Bufferで2.2×10-10Mに希釈した場合)。

  GLB CCLR PLB RLB
ホタルルシフェラーゼアッセイ
デュアルシフェラーゼアッセイ × × ×
CATアッセイ ×
β-ガラクトシダーゼアッセイ * *
GUSアッセイ
溶解力
酵素安定性
タンパク質定量 ***
イノムアッセイ ○(WES) ○(ELISE,WES) ○(ELISE,WES) ○(ELISE,WES)
能動的溶解
受動的溶解 ×
泡立ち防止 × ×
* 停止液として1M Tris(pH8.0)を使用した場合 -:未確認
** 界面活性剤適応タンパク質定量試薬の場合 WES:ウエスタンブロッティング
*** 水で2倍以上希釈すれば測定可能  

 

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Q.プロメガの細胞溶解剤では、どのようなレポーターアッセイやタンパク質測定法が行えますか?

プロメガの各細胞溶解剤で行うことができるレポーターアッセイやタンパク質測定法の一覧表

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