プロメガ製品 Q & A 【 in vitro転写/翻訳 】

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In vitro 転写・翻訳(TNT System)

Q. TNT® Systemとはどのような製品ですか?

Q. TNT® System のうち、RRLとWGEのどちらを選択すればよいですか?

Q. プロモーターはどれを選択すればよいですか?

Q. 鋳型DNAはどのように調製すればよいですか?

Q. TNT® Systemではribosomal binding site (RBS) は必要ですか?

Q. 翻訳効率を高めるための因子はありますか?また、pTNT® Vector、 pCMV TNT® Vectorにあるβ-グロビンリーダーシークエンスとは何ですか?

Q. TNT® Systemに用いる鋳型DNAの注意点を教えてください。

Q. TNT® Quick Coupled Transcription/Translation SystemとTNT® Coupled Reticulociyte Lysate Systemでは何が違うのですか?

Q. どれくらいの大きさのタンパク質を翻訳することができますか?また、1反応あたりどれくらいの量のタンパク質を得ることができますか?

Q. TNT® Systemで実施する転写・翻訳反応スケールの変更はできますか?

Q. TNT®Systemに付属のT7 RNA Polymerase、SP6 RNA Polymerase、T3 RNA Polyemeraseが途中でなくなってしまった場合、単品で販売しているRNA Polymeraseで代用できますか?

Q. Non-RIの系で翻訳反応はできますか?

Q. TNT® Systemで翻訳させたタンパク質の発現をどのように解析すればよいですか?また、システムに付属のコントロールDNAを転写・翻訳したルシフェラーゼはどのようにして発現を確認しますか?

Q. TNT® Systemで翻訳させたタンパク質の発現を確認したときにサンプル以外のエキストラバンドが認められました。どのようにすればよいでしょうか?

Q. TNT® Systemで翻訳させた溶液からヘモグロビンを除去することはできますか?

Q. TNT® Systemで翻訳させた溶液から目的タンパク質を精製することはできますか?

[ 解 答 ]

In vitro 転写・翻訳(TNT System)

Q. TNT® Systemとはどのような製品ですか?

A. TNT® SystemのTNTとは、Transcription and Translationの略です。このシステムでウサギ網状赤血球ライセート(Rabbit Reticulocyte Lysate: 以下RRL)または小麦胚芽抽出液(Wheat Germ Extract、以下WGE)を含む反応液に鋳型DNAを添加するだけで、in vitro転写・翻訳反応を行うことができます。

原核生物(大腸菌抽出物:E. coli S30 Extract)の転写翻訳システムについては、こちらをご参照ください。また、翻訳反応のシステムについては、こちらをご参照ください。

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Q. TNT® System のうち、RRLとWGEのどちらを選択すればよいですか?

A. 合成したいタンパク質の由来、鋳型DNAの形態(環状DNAまたは直鎖DNA)と鋳型DNAに含まれるプロモーター配列 (T7, SP6, T3) から最適なTNT® Systemを決定してください(表1~表3)。

表1 in vitro 翻訳システムの鋳型の由来による選択ガイド

表2 アプリケーションによるin vitro タンパク質翻訳システム選択ガイド

表3 TNT Systemと鋳型DNA、プロモーターの組み合わせ

TNT® System
製品名
ライ
セート
鋳型DNA マスタ
ーミッ
クス*
コント
ロール
DNA
プロモーター
TNT® T7 Quick
for PCR DNA
RRL 環状DNA (可能)
直鎖DNA (推奨)
不含 T7 Promoter
TNT® Quick Coupled
Transcription /
Translation System
RRL 環状DNA (推奨)
直鎖DNA (可能)
不含 T7 Promoter
SP6 Promoter
TNT® Coupled
Rabbit Reticulocyte
Lysate System
RRL 環状DNA (推奨)
直鎖DNA (可能)
× T7 Promoter
T3 Promoter
SP6 Promoter
TNT® Coupled
Wheat Germ
Extract System
WGE 環状DNA (許容)
直鎖DNA (許容)
× T7 Promoter
T3 Promoter
SP6 Promoter

*:マスターミックスとは、RRLと反応Buffer、アミノ酸Mixture (minus メチオニン)の混合溶液になっているため、試薬調製の際に各反応組成溶液を分注するステップが簡略化できます。

一般的には、哺乳類由来のタンパク質発現を目的とした場合に、RRLを使用し、植物由来のタンパク質合成などには、WGEを使用します。膜タンパク質の合成、翻訳後修飾(糖鎖付加、リン酸化など)必要とする発現系については、RRLが研究報告などから有効と考えられています。

ただし、以下に示す鋳型DNAとプロモーター、TNT® Systemの組み合わせは避けてください。

1) 直鎖DNA、 SP6 promoter、RRL またはWGE

2) 環状DNA 、T7 promoter、 WGE

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Q. プロモーターはどれを選択すればよいですか?

A. TNT® Systemでは、SP6、T7、T3プロモーターのいずれかを選択します。この3つのプロモーターは、バクテリオファージ由来のRNA Polymeraseにより鋳型DNAのプロモーター配列を特異的に認識してRNAを合成します。それぞれのRNA polymeraseの性質や特徴は、似ていると考えられています(1-4)。

プロモーターは、TNT® Systemライセート、鋳型DNAの組み合わせで選択することもできます(表4)。

表4  TNT® Systemのライセートとプロモーターの組み合わせ

TNT® System SP6 Promoter T7 Promoter T3 Promoter
TNT® RRL 環状DNAを使用した場合に最も効率のよい翻訳ができます。
直鎖DNAの使用は推奨しません
環状DNAを使用した場合に最も効率のよい翻訳ができます。
直鎖DNAの使用は、許容範囲内です。
環状DNAを使用した場合に最も効率のよい翻訳ができます。
直鎖DNAの使用は、許容範囲内です。
TNT® WGE 環状DNAを鋳型として用いた場合は、最も効率のよい翻訳ができます。
直鎖DNAの使用は推奨しません
環状DNAの使用は推奨しません
直鎖DNAを使用した場合は、コーディング領域の下流にT7 termination配列が必要です
環状DNA、直鎖DNAいずれも使用できます。

参考文献:

  1. Butler, E.T. and Chamberlin, M.J. (1982) J. Biol. Chem. 257, 5772-5778.
  2. Chamberlin, M., McGrath, J. and Waskell, L. (1970) Nature 228, 227-231.
  3. Dunn, J.J., Bautz, F.A. and Bautz, E.K.F. (1971) Nature (London) New Biol. 230, 94-96.
  4. Chamberlin, M. and Ryan, T. (1982) In The Enzymes (Boyer, P.D., ed.), Vol. 15, Nucleic Acids, Part B, pp. 87-108, Academic Press, New York.

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Q. 鋳型DNAはどのように調製すればよいですか?

A. 鋳型DNAは、環状DNA (Plasmid DNA)または直鎖 DNA (DNA fragment、PCR産物)を調製します。

1) 環状 DNA を使用する場合

  • pTNT® Vector(L5610)または、pCMVTNT® Vector(L5620)のマルチクローニングサイトに遺伝子配列を挿入することができます。この場合は、開始コドン(ATG)を遺伝子配列に入れてください。
  • pTNT® Vector, pCMVTNT® Vector以外のVectorを使用する場合は、TNT Systemで使用するプロモーター配列、開始コドン、終止コドン、T7 terminator配列(必要に応じて)をご確認ください。

注意:pTNT® Vector、pCMVTNT® Vectorには翻訳効率を上げるためにβ-グロビン5’-リーダーシークエンス配列を含んでいます。鋳型DNAの配列によっては、転写・翻訳反応の効率が低いい場合もあります。使用するテストサンプルと同時にシステムに付属のControl反応を実施してください。

2) 直鎖DNAを使用する場合

  • 環状DNAを制限酵素で切断し、直鎖DNAにする場合
    →平滑末端で切断できる制限酵素を使用してください。突出末端で切断した場合は、Klenow Fragmentなどで平滑末端処理をしてください。
  • PCRにより鋳型DNAを調製する場合(TNT® Quick for PCR DNA)
    →forward primerとしてT7 promoter配列+スペーサー配列+Kozakの配列を含むように設計します(表5)。

表5 TNT® Quick for PCR DNAで用いられたT7プロモーターの配列

制限酵素サイト T7 Bacteriophage
Sequence
Spacer Eukaryotic Translation
Initiation Sequence
参考文献
GGATCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG AG CCC ACC ATG 5,6
GGATCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG AG CCC ACC ATG G 7,8
GGATCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG G AA CAG CCC ACC ATGG 9,10
nnn TAA TAC GAC TCA CTA TAG G AA CAG CCC ACC ATG 11,12

3) TNT® System反応に用いる鋳型DNAの精製方法

環状DNAは、Wizard® Plus SV Minipreps (A1330など)を用いて精製することを推奨しています。直鎖DNAは、Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (A9281)で精製することを推奨しています。

精製後のDNAは、OD260nm/OD280nmを測定し、ratio=1.8以上となるようにしてください。ratio=1.8以下の場合は、エタノール沈殿を実施してください。ratioが1.8よりも小さい鋳型DNAを使用した場合、転写・翻訳の効率は低下します。

<参考>
一般的には、環状DNAを鋳型とする場合は、RRLが好ましいといわれます。WGEの反応は、RRLよりも高いマグネシウム、カルシウム濃度を必要とします(社内データ)。そのため、鋳型である環状DNAは高次構造(super coiled)を形成してしまい、その結果として、転写・翻訳の効率が低下する可能性があります。

参考文献:

  1. Lancaster,J.M.et al.(1996)Nat.Genet.13, 238.
  2. Sarkar,G.and Sommer,S.S.(1989)Science 244, 331.
  3. Liu,B.et al.(1994)Cancer Res.54, 4590.
  4. Papadopoulos,N.et al.(1994) Science 263,1625.
  5. Roest,P.A.M.et al.(1993)Hum. Mol.Genet. 2, 1719.
  6. van der Luijt,R.et al.(1994) Genomics 20, 1.
  7. Hogervorst,F.B.L.et al.(1995) Nat.Genet.10, 208.
  8. Lo Ten Foe,J.R.et al.(1996) Nat.Genet.14 ,320.

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Q. TNT® Systemではribosomal binding site (RBS) は必要ですか?

A. TNT® Systemの翻訳反応では、ribosomal binding site(RBS)は必要ではありません。

原核生物の翻訳反応のときに開始コドン上流からおよそ9塩基がribosomal binding site(RBS)として必要になります。また、この配列は二次構造を形成しません。真核生物の場合では、キャップ構造の有無や、internal ribosomal entry site(IRES)にかかわらず、開始コドンの「AUG」の前後に翻訳に必要なKozakのコンセンサス配列をもつことが必要です。

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Q. 翻訳効率を高めるための因子はありますか?また、pTNT® Vector、 pCMV TNT® Vectorにあるβ-グロビンリーダーシークエンスとは何ですか?

A. β-グロビンリーダーシークエンスは、外部から挿入した異種mRNAの転写効率を上げるために使用しています。β-グロビンリーダーシークエンスを5’UTRに付加することで、さまざまな種類の遺伝子の翻訳効率の増加が報告されています(13, 14)。

<参考>
翻訳効率を高める因子として、以下の点が挙げられます。

  1. 開始コドン前後のKozakのコンセンサス配列
  2. PolyA Tailまたは3’非翻訳領域(3’UTR)
  3. 5’ キャップ構造(m7G(5)ppp(5)G Cap Analog)は、翻訳開始因子と結合します。
  4. 5’非翻訳領域(5’UTR)にIRESの配列を付加することで、翻訳効率が向上することがわかっています。

参考文献:

  1. Falcone, D. and Andrews, D.W. (1991) Both the 5´ untranslated region and the sequences sur-rounding the start site contribute to efficient initiation of translation in vitro. Mol. Cell. Biol.11, 2656–64..
  2. Annweiler, A., Hipskind, R.A. and Wirth, T. (1991) A strategy for efficient in vitro translation of cDNAs using the rabbit β -globin leader sequence. Nucl. Acids Res. 19, 3750.

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Q. TNT® Systemに用いる鋳型DNAの注意点を教えてください。

A. 以下の点を確認してください。

  1. 鋳型DNAの精製度OD260nm/OD280nmを測定し、ratio=1.8以上となっていますか?
  2. Kozakのコンセンサス配列(GCCGCCA/GCCAUGG)が入っていますか?
  3. 終止コドン(TAA、TAG 、TGA)やPolyAは入っていますか?
  4. 5'-UTRの長さはどれくらいですか?2次構造を作る程度に長くなっている場合は、短くしてください。

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Q. TNT® Quick Coupled Transcription/Translation SystemとTNT® Coupled Reticulociyte Lysate Systemでは何が違うのですか?

A. TNT® Quick Coupled Transcription/Translation Systemは、TNT® Quick Master Mixを使用します。マスターミックスは、RRL、反応Buffer、アミノ酸ミックス (マイナス メチオニン)の混合溶液になっているため、試薬調製の際に各反応組成溶液を分注するステップが簡略化できます。RI標識する場合は、[35S]Metのみ使用できます。

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Q. どれくらいの大きさのタンパク質を翻訳することができますか?また、1反応あたりどれくらいの量のタンパク質を得ることができますか?

A. 社内データでは、約15kDa~100kDaの分子サイズのタンパク質を翻訳できることを確認しています。約200kDaの大きさのタンパク質を翻訳している報告例もあります。
RRLでのタンパク質の翻訳は、ユビキチン化が起こると考えられ(15)、15kDa以下のタンパク質翻訳には推奨しません。
WGEは、RRLよりも小さいタンパク質の翻訳反応に向いていると考えられます。ただし、翻訳できる分子サイズ、翻訳量、転写・翻訳の効率は遺伝子配列に依存します。

RRLおよびWGEを用いたTNT® Systemでは、150~300ng/ 50uL 反応スケールのタンパク質量を翻訳できます。

参考文献:

  1. Anne P. Døskeland and Torgeir Flatmark (2002) Eur. J. Biochem. 269, 1561-1569.

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Q. TNT® Systemで実施する転写・翻訳反応スケールの変更はできますか?

A. プロメガでは、50uLを標準的な反応スケールとしています。TNT® Systemの転写翻訳効率を考えたとき、1反応あたり25~100uLのスケール範囲内で使用できると考えられています。

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Q. TNT®Systemに付属のT7 RNA Polymerase、SP6 RNA Polymerase、T3 RNA Polyemeraseが途中でなくなってしまった場合、単品で販売しているRNA Polymeraseで代用できますか?

A. 単品販売のRNA polymeraseとは異なる成分となっており、代用することはできません。TNT® Systemで使用するRNA polymeraseは、転写・翻訳反応を1つの反応溶液で実施するために最適化されています。必ずTNT® Systemに付属しているRNA Polymeraseをご使用ください。また、TNT Systemのうち、異なるライセート(RRLまたはWGE)ではRNA Polymeraseの成分が異なります。

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Q. Non-RIの系で翻訳反応はできますか?

A. 可能です。プロメガでは、FluoroTect™ GreenLys in vitro Translation Labeling System(L5001)またはTranscend™ Non-Radioactive Translation Detection Systems(L5070など)を用いて蛍光標識またはビオチン標識することができます。この場合の転写・翻訳の反応溶液には、コンプリートのアミノ酸を用いください。また、Luciferase Control RNAを用いた翻訳反応から、WGEのライセートを使用したときにエキストラバンドの出現を確認しています(翻訳反応Q&A参照)。

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Q. TNT® Systemで翻訳させたタンパク質の発現をどのように解析すればよいですか?また、システムに付属のコントロールDNAを転写・翻訳したルシフェラーゼはどのようにして発現を確認しますか?

A. プロメガでは、RI標識またはウエスタンブロットによる発現確認を推奨しています。SDS-PAGE後のCBB®染色は、ライセート由来のタンパク質のバックグランドのバンドも出現するため推奨していません。

TNT® Systemのうち、コントロールDNAで発現させたルシフェラーゼは、製品に付属のLuciferase Assay Reagentをライセートサンプルに添加して発光量を測定することができます(ルミノメーターで測定)。ルミノメーターを所有していない場合は、Anti-Luciferase pAb(G7451)を用いてウエスタンブロットで確認することができます。ルシフェラーゼタンパク質は61kDa付近にバンドが出現します。

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Q. TNT® Systemで翻訳させたタンパク質の発現を確認したときにサンプル以外のエキストラバンドが認められました。どのようにすればよいでしょうか?

A. 主に、以下の点が挙げられます。

  1. TNT® Systemで使用しているRRLはヘモグロビン由来の42kDaのバックグランドがあります。この場合は、ライセートを透析などで除去してください。
  2. Aminoacyl tRNAの25kDaもバックグランドとして出現する可能性があります。この場合は、RNase AをTNT反応後の溶液に0.2mg/mLとなるよう添加し、30℃、5分間インキュベーションを行ってください。
  3. SDS-PAGEの際に酸化してしまっているβ-メルカプトエタノールを用いた場合にも非特異的なバンドが出現することがあります。SDS-PAGEに使用するLoading Bufferをなるべく、2% SDSと100mMのDTTを使用してください。

ライセート由来のバックグランドについては、各製品プロトコルのトラブルシューティングの項をご参照ください。

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Q. TNT® Systemで翻訳させた溶液からヘモグロビンを除去することはできますか?

A. 酢酸溶液を使ってRRL由来のヘモグロビンを除去することができます。以下に操作手順を紹介します。

  1. 60uLのRRL反応溶液に対し17.4M 酢酸溶液を1uL添加し、試験紙を用いて pHを確認します。水で20倍希釈し、再びpHを確認します。
  2. 遠心すると、沈殿物にあるタンパク質は茶色となっており、上清液は、濃紅色(または茶色)になっています。上清液は除去してください。沈殿物は、50uLのBuffer (40 mM imidazole, 4 M NaCl, 160 mM Tris-HCl pH 7.9)でよく懸濁して溶解させる。
  3. 沈殿物がよく溶けない場合は、65℃、10分間温めてください。
  4. 1,400xg 10分間遠心すると、沈殿物と上清液に分離します。沈殿物と上清液は 1X sample buffer に溶解し、SDS-PAGEにアプライします。

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Q. TNT® Systemで翻訳させた溶液から目的タンパク質を精製することはできますか?

A. 目的タンパク質にHisTagまたはGST-Tagがあれば、MagZ™ Protein Purification System(V8830)またはMagneGST™ Protein Purification System(V8600など)を使ってTNT® 反応溶液から目的タンパク質を精製することができます。

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