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プロメガ製品 Q & A 【 トランスフェクション 】

 

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Q.ネオマイシン耐性遺伝子をトランスフェクションした後、安定にトランスフェクトされた細胞の選択を行うには、どれくらいのG-418 Sulfateが必要ですか。

Q.Antibiotic G418 Sulfate Solution (カタログ番号 V8091)の濃度を教えてください。

 

  安定性トランスフェクション

 G418

Q.ネオマイシン耐性遺伝子をトランスフェクションした後、安定にトランスフェクトされた細胞の選択を行うには、どれくらいのG-418 Sulfateが必要ですか。

トランスフェクトされなかった細胞を殺すために必要なG-418 Sulfateの適切な濃度は、一般的にはそれぞれの細胞株ごとに経験的に決定されています。増殖しているトランスフェクトされていない細胞を7~10日以内に殺すには、100-800μg/mlで一般的には十分です。G-418が細胞内でneorにコードされている酵素によって不活性化されるようになると、定期的に(通常2、3日毎に)培地を交換する必要があります。G-418の効果は、トランスフェクトしたプレートと同じ細胞濃度で生育させたモックの細胞を含むコントロールプレートで確認することができます。

多くの真核細胞用発現ベクター(例えばpCI-neo Vector)には、ネオマイシン耐性遺伝子(neor)と一般的に呼ばれるアミノグリコシド・ホスホトランスフェラーゼをコードする細菌のTn5遺伝子が含まれます。G-418は、ネオマイシン(細菌の抗生物質)の真核生物用の類似体で、タンパク質の翻訳を阻害し、活発に分裂している細胞を死へと導きます。

neorを(目的の遺伝子とともに)取り込み、インテグレートしたトランスフェクト細胞は、抗生物質であるG-418 Sulfate(カタログ番号V7981、V7982、V7983)の存在下で増殖させることにより選択できます。選択を成功させるためには、トランスフェクトされた細胞を選択の期間を通じて増殖させなければなりません。そのためには、細胞がコンフルエントになったところで細胞を分け、モックの細胞すべてが死ぬまでG-418を培地に含有させつづけます。最後に選択された細胞集団は、選択された細胞のグループであり、必要ならばクローン選択を行います。

別の方法は、生存している細胞を96穴プレートの各ウェルに1つずつ含まれるように希釈して蒔くことです。選択が維持され、neorを含む細胞だけがクローン細胞を形成します。しかし、この方法は低い細胞濃度に耐えられない細胞種では難しい場合があります。(PN72-FAQ)

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Q. Antibiotic G418 Sulfate Solution (カタログ番号 V8091)の濃度を教えてください。

この製品は40~60mg/mlの濃度で調製されています。ロットにより若干の違いはありますが、多くの場合、50~55mg/mlの濃度で提供いたします。正確な濃度は、各製品の添付資料に記載しております。

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