プロメガ製品 Q & A 【 プラスミド精製 】

 

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Q.ロー(低)コピー・プラスミドとハイ(高)コピー・プラスミドの違いは何ですか。

QWizard® Plus Minipreps (カタログ番号 A7100)とWizardR Plus SV Minipreps (カタログ番号 A1340)の違いは何ですか?

QWizard® Plus SV Minipreps Systemで精製したプラスミドを自動蛍光DNAシークエン    
     スに使えますか?

Q.最終産物のDNAペレットがMagneSil™ PMPを使った後に茶色く見えるのですが、なぜですか。どうしたら避けることができるでしょうか。

 

 

 プラスミド精製

プラスミド精製 一般

Q.ロー(低)コピー・プラスミドとハイ(高)コピー・プラスミドの違いは何ですか。

プラスミドのコピー数は、プラスミドDNAの収量に関わる重要な要因の一つです。コピー数は、プラスミド中の複製起点とその周辺のDNAの領域によって決まります。この領域(レプリコンとして知られている)は、細菌の酵素複合体によるプラスミドの複製を制御しています。pBR322由来のプラスミドは、pMB1からのColE1複製起点を含みます。この複製起点は、厳格に制御されており、細菌(ローコピー)あたり約25コピーのプラスミドを複製します。pUC由来のプラスミドには、変異導入されたColE1複製起点が含まれ、複製制御が緩くなり細胞あたり200~700のプラスミド(ハイコピー)を複製します。

プラスミドの中には、ローコピー数の複製起点と考えられるp15a複製起点(例えばpALTERR-Ex2 Vector(b))を含むものもあります。p15a複製起点の存在により、このプラスミドはColE1複製起点を持つプラスミドと共に複製できます。同じ菌体中に共存できないプラスミドのグループとして和合性グループが定義されます。和合性グループのプラスミドは、プラスミドの維持に不可欠なステージで細菌がそれらを区別できないために不和合となります。同じ和合性グループから第2のプラスミドとして新しい複製起点を導入すると、その細胞中に存在するプラスミドの複製結果を模倣します。そのため、正しい複製前のコピー数になるように2つのプラスミドが別々の細胞に分けられるまで、プラスミドの複製は阻害されます(2)。

pGEM Vectors(b)を含む、プロメガが提供するほとんどのプラスミドは、ハイコピーだと考えられています。ローコピーであると考えられているベクターは、pALTERRのシリーズの変異導入ベクターと、pET-5/pET-9(c)およびpGEMEXR-1/pGEMEXR-2(b,c)シリーズの大腸菌発現ベクターだけです。(PN68-FAQ)

参考文献:
1)Lewin, B. (1990) In: Genes IV, Oxford University Press, New York, 338
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Q.Wizard® Plus Minipreps (カタログ番号 A7100)とWizardR Plus SV Minipreps (カタログ番号 A1340)の違いは何ですか?

Wizard® Plus MiniprepsとWizard® Plus SV Minipreps DNA Purification Systemではカラムの形状と予想される収量が異なります。Wizard® Plus Minipreps Systemでは、DNAと結合する少しどろどろした懸濁液状のレジンを使っています。これを透明な細菌のアルカリ溶解液と混合し、真空ポンプによる吸引またはシリンジによる加圧によってWizard® Minicolumn(カタログ番号 A7211)を通過させます。一方、Wizard® Plus SV Minipreps System ではMinipreps Spin ColumnにDNAと結合するメンブランが組み込まれています。透明な細菌のアルカリ溶解液がカラムを通過するときにDNAの結合が起こります。Wizard® Plus SV Minipreps Systemではプラスミドの精製に遠心(spin)と吸引(vacuum)のどちらかを選択できます。

高コピー数プラスミド(例えば、pGEMR Vector)を標準的な大腸菌株(例えば、JM109)に形質転換し、LB培地1~3mlで増やした場合、Wizard® Plus Minipreps Systemで予想されるプラスミドDNAの収量は1~10μgです。一方、Wizard® Plus SV Minipreps Systemでは5mlまでの使用が推奨され、20μgまでの回収が可能です。Wizard® Plus SV Miniprep Systemで低コピー数プラスミドを精製する場合、より大量の培地を処理することができます。プロメガではどちらのシステムを使う場合でも、富栄養培地(例えば、Terrific Broth)の使用を薦めません。生物量が多いとカラムの目詰まりを起こしたり、細胞溶解の許容量を超過する可能性があるからです。両方のシステムともに制限酵素消化、PCR、in vitro転写/翻訳、蛍光DNAシークエンスを含む多様なアプリケーションに適した高品質なDNAを精製することができます。

Wizard® Plus SV Minipreps System独自の特長は精製過程においてアルカリプロテアーゼ処理を行うことです。このプロテアーゼをアルカリ溶解液に加えると、タンパク質を分解し、除きやすくします。また、Wizard® Plus SV Minipreps Systemにアルカリプロテアーゼを使うことでエンドヌクレアーゼAによるDNA分解を大幅に減らすことができます。このエンドヌクレアーゼAは一般的にHB101やJM101のようなendA+の大腸菌株で見られます。(eNotes-FAQ0003)

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Wizard Plus SV Minipreps System

Q.Wizard® Plus SV Minipreps Systemで精製したプラスミドを自動蛍光DNAシークエンスに使えますか?

自動蛍光DNAシ-クエンスでは、適切な濃度範囲で精製されたプラスミドが必要です。理想的な濃度は0.2μg/μlであり、0.1μg/μl以下ではシークエンシングできません。pGEM® Vectorが形質転換されたDH5αを1.5ml LB培地で培養し、Wizard® Plus SV Minipreps Systemで精製した場合、通常3.5-5.0μg のプラスミドDNAが得られます。Wizard® Plus SV System を使えば、EndA- とEndA+のどちらから精製したDNAでもABI PRISMR BigDye™ターミネーターシークエンスを用いた自動化蛍光DNAシークエンスに適しています。

terminator ready reaction mixの希釈を行う場合、D.W.ではなく適したバッファー(250mM Tris-HCl [pH 9.0], 10mM MgCl2)で希釈することが重要です。高コピー数プラスミドを6倍希釈したterminator ready reaction mixで解析した場合、500塩基以上の判読が可能であり、98%かそれ以上の正確さで判読できます。希釈の方法については、Wizard® Plus SV Minipreps Systemのプロトコール(TB225)に記載されています。このプロトコールではサンプル調製にエタノール沈殿は不要です。(eNotes-FAQ0010)

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 トランスフェクショングレード

MagneSil PMP

Q.最終産物のDNAペレットがMagneSil™ PMPを使った後に茶色く見えるのですが、なぜですか。どうしたら避けることができるでしょうか。

DNAペレットが茶色く見えるのは、MagneSil™ PMPが残留していることを示しています。DNA溶出のために高純度の精製水を加えた後は、プロトコルで述べられているようにチューブをMagneSil™ Magnetic Separation Unit(カタログ番号A2231)にきちんと3分間置いておくことが重要です。3分以内にチューブをUnitからはずすと、MagneSil™ PMPが溶液から迅速に取り除かれたように見えても、溶液中に少量のMagneSil™ PMPが残留している可能性があります。

溶出されたDNAから残留している粒子を取り除くためには、最後のエタノール沈殿の前に追加の操作を行います。溶出したDNAを含む上清を14,000 xgで1分間遠心することで取り除くことができます(この遠心を行うには、Corning Corex #8446ガラス・チューブやNalgene Oak Ridgeプラスチック・チューブなどの上記の遠心に耐えられるチューブを使う必要があります)。上清を新しいチュープに移し、エタノール沈殿のステップに進みます。(PN71-FAQ)

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