プロメガ製品 Q & A 【 タンパク質精製 】

 


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Q. MagneHis™ Protein Purification System (以下MagneHis™)は、どのような製品ですか?

Q. 操作時間はどれくらいですか?

Q. MagneHis™ Ni-Particlesの粒子径はどれくらいですか?また、どのような溶液に懸濁させた状態ですか?

Q. MagneHis™ Ni-Particlesの保存期間はどれくらいですか?

Q. MagneHis™ Ni-ParticleのHisTagタンパクの結合容量はどれくらいですか?

Q. MagneHis™ Ni-Particlesの再使用はできますか?

Q. HisTagタンパクの精製には、MagneHis™ 以外に用意する製品はありますか?

Q. MagneHis™ のキット付属品の単品販売はありますか?

Q. HisTag融合タンパクは、販売していますか?あるいは別売りで購入できるものを紹介してください。

Q. HisTag タンパクを精製後、抗体作製用の抗原として使用したいと思います。HisTagの影響はありますか?

Q. 不溶性タンパク質を精製することはできますか?

Q. イミダゾールを使った洗浄を行うと、目的タンパク質が失活してしまいます。イミダゾールを含まないBufferを使用できますか?

Q. 他の溶媒を使用した際のマグネット粒子の耐性はどれくらいですか?

Q. キットの構成が(2005年5月以降から)変更になったようですが、変更点を教えてください。

 

MagneHis™ Protein Purification System

MagneHis™ Protein Purification System (以下MagneHis™)は、どのような製品ですか?

大腸菌および培養細胞(哺乳動物および昆虫)で発現させたポリヒスチジンタグ(以下、HisTag)タンパクを分離、精製するシステムです。

磁性体粒子であるMagneHis™ Ni-Particlesは、HisTagタンパクと相互作用します。続いて、マグネットスタンドを用いながら、HisTagタンパクがMagneHis™ Ni-Particlesに結合した状態で洗浄操作を行い、MagneHis™ Elution Buffer (100mM HEPES: pH7.5, 500mM imidazole)でHisTagタンパクを溶出させます。MagneHis™ の精製プロトコルの概要を図1に示します。

図1 MagneHis™ Protein Purification SystemによるHisTagタンパク精製プロトコルの概要

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操作時間はどれくらいですか?

精製するサンプルの数によって異なりますが、 約20分程度でHisTagタンパクを精製できます。

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MagneHis™ Ni-Particlesの粒子径はどれくらいですか?また、どのような溶液に懸濁させた状態ですか?

MagneHis™ Ni-Particleの粒子径は2~14μmです。精製水に懸濁させています。

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MagneHis™ Ni-Particlesの保存期間はどれくらいですか?

4℃で約1年間です。

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MagneHis™ Ni-ParticleのHisTagタンパクの結合容量はどれくらいですか?

MagneHis™ Ni-Particle溶液1mL当たり1mgです。

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MagneHis™ Ni-Particlesの再使用はできますか?

プロメガでは、HisTagタンパクの回収率の再現性を考慮し、MagneHis™ Ni-Particlesの再使用を推奨していません。

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HisTagタンパクの精製には、MagneHis™ 以外に用意する製品はありますか?

マグネットスタンドが必要になります。15mLもしくは50mL用のスタンドとしてPolyATtract® System 1000 Magnetic Separation Stand (Z5410)、または 0.5mL用(Z5331)、1.5mL用(Z5332)があります。

哺乳動物細胞または、昆虫細胞からHisTagタンパクを精製する場合は、1M イミダゾール溶液(pH8.0)および塩化ナトリウム粉末が必要になります。製品プロトコルTM060, pg.4をご参照ください。

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MagneHis™ のキット付属品の単品販売はありますか?

MagneHis™ Ni-ParticlesとFastBrak™ Cell Lysis Reagent, 10X を販売しています。各製品のカタログ番号、サイズ、定価は表1のとおりです。

表1 MagneHis™のキット付属品

製品名 カタログ番号 サイズ
MagneHis™ Ni-Particles V8560
V8565
(2mL)
(10mL)
FastBrak™ Cell Lysis Reagent, 10X V8571
V8572
V8573
(10mL)
(40mL)
(100mL)

 

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HisTag融合タンパクは、販売していますか?あるいは別売りで購入できるものを紹介してください。

プロメガではHisTagタンパクを販売しておりません。CALBIOCHEMR社で、ヒトおよびラットの脳(Rab1~Rab15)のHisTag融合タンパク(リコンビナント)を販売しています。

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HisTag タンパクを精製後、抗体作製用の抗原として使用したいと思います。HisTagの影響はありますか?

His自体は小さなタンパク質 (0.84kDa)ですので、免疫原性はないと考えられます。

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不溶性タンパク質を精製することはできますか?

不溶性タンパクの場合、Denaturing Conditionで行っていただくことになります。Denaturing Conditionのプロトコルは製品マニュアルをご参考ください。

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イミダゾールを使った洗浄を行うと、目的タンパク質が失活してしまいます。イミダゾールを含まないBufferを使用できますか?

MagneHis™ Ni-Particlesのみを購入し、適切なバッファーで精製することができます。MagneHisTM Ni-Particlesの耐性表をご参照ください(表2)。また、溶出時のイミダゾールは、脱塩カラムを使用して取り除くことができます。

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他の溶媒を使用した際のマグネット粒子の耐性はどれくらいですか?

以下の試薬に対するMagneHis™ Ni-Particlesの耐性表があります (Technical Manual TM160, pg.10 Table 3)。それ以外の試薬に関しては、別途お問い合わせください。

表2 試薬および別のBufferを使用した際のマグネット粒子の耐性

試薬 濃度
β-メルカプトエタノール 100mM 以下
陽イオン性界面活性剤 1%
DTT 100mM以下
EDTA 5mM以下
グリセロール 20%以下
グアニジン-HCl 8M以下
塩化ナトリウム 1M以下
塩化ナトリウム 1M以下
Tris, MOPS, リン酸ナトリウム、
リン酸カリウムの各種Buffer
100mM
Triton® X-100 1%
Tween® 20 0.05%
尿素 8M以下

 

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キットの構成が(2005年5月以降から)変更になったようですが、変更点を教えてください。

以下の点が変更になりました。

1)Cell Lysis ReagentがFastBreak™ Cell Lysis Reagent, 10Xになりました。
→今までは大腸菌培養液のサンプルを遠心し、集菌してから、細胞溶解操作を実施していました。新しいシステムでは、遠心の操作は不要で、直接細胞懸濁液にFastBreak™ Cell Lysis Reagent, 10Xを加えることができます。

2)キットの構成品として、新たにDNase Iが添付されています。
→FastBreak™ Cell Lysis Reagentのサンプル溶解液にDNase I溶液を直接添加することで、効率的に細胞を溶解することができます。

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