プロメガ製品 Q & A 【 MultiFectam 】

 

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Q.試薬の保存期間(凍結乾燥品/溶解後)について教えてください。

Q.DNAと試薬は、どの比率で混合する場合が最も導入効率が良いですか?

Q.遺伝子導入試薬添加後に培地交換する必要はありますか?

Q.血清を含む培地を使ってもよいとありますが、無血清培地を使うとさらに導入効果は高まりますか?

Q.DNAを溶解する溶液として20mM Tris-HClが推奨されていますがTE(Tris/EDTA)では可能ですか?

Q.siRNAをTEもしくは滅菌水で溶解して使用することは可能ですか?

Q.DNA、MultiFectamの複合体調製時にOPTI-MEMR培地の替わりにPBSが使えますか?

Q.遺伝子を多く導入したい場合には?

Q.24wellプレート以外では何回分の導入が可能ですか?

Q.どんな細胞での実施例がありますか?

 

 トランスフェクション試薬

MultiFectam

Q.試薬の保存期間(凍結乾燥品/溶解後)について教えてください。

未溶解の製品(凍結乾燥品)は4℃での保管で2年間保存可能です(-20℃でも保存可能)。
水に溶解後は、4℃で3ケ月間の保存が可能ですが、-20℃で保管していただきますとより長期保存(6カ月)が可能です。
凍結融解は6回までの安定性を確認しております。

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Q.DNAと試薬は、どの比率で混合する場合が最も導入効率が良いですか?

細胞によって最適な混合比が異なります。
いくつかの混合比を検討してお試しいただき最適な混合比を決定してみてください。
プラスミドとMultiFectamの最適な混合比を検討するプロトコールを用意しています。
24wellでの例と96wellでの例

1. 様々な細胞培養フォーマットにおけるトランスフェクションスケール

  Growth Area
培地量
(ml)
MultiFectam
( μl)
DNA -Tris 溶液 Opti-MEMR
(μl)
1 ウェルあたりの添加量
(μl)
DNA/total volume
96-well 0.32 cm2 0.1 2.5 0.1 μg / 5.0 μl 2.5 10
48-well 0.82 cm2 0.2 5.0 0.2 μg / 10.0 μl 5.0 20
24-well 1.88 cm2 0.5 12.5 0.5 μg / 25.0 μl 12.5 50
12-well 3.83 cm2 1.0 25.0 1.0 μg / 50.0 μ 25.0 100
6-well 9.4 cm2 2.5 62.5 2.5 μg / 125 μ 62.5 250
35 mm 8.0 cm2 2.0 50.0 2.0 μg / 100 μl 62.5 250
60 mm 21 cm2 5.0 125 5.0 μg / 250 μl 125 500
100 mm 55 cm2 10.0 250 10 μg / 500 μl 250 1000

※CorningR culture dishes のデータによります。MultiFectam とプラスミドDNA 溶液との最適混合比率・添加量は、細胞種および実験条件により異なることがあります。



2. MultiFectam とプラスミドDNA-Tris 溶液の混合比率と添加量

混合比 MultiFectam DNA -Tris 溶液 Opti-MEMR 1 ウェルあたりの添加量
DNA/total volume
A ※1 8.4 μl 0.5 μg / 29.1 μl 12.5 μl 20 - 50 μl
B ※2 12.5 μl 0.5 μg / 25.0 μl 12.5 μl 50 - 100 μl ※4
C ※3 16.7 μl 0.5 μg / 20.8 μl 12.5 μl 50 - 100 μl ※4

A※1:高発現が期待できますが、毒性がみられることがあります。添加量を少なくすることをお勧めいたします。
B※2:多くの細胞種において最適な条件です(標準法)。
C※3:低毒性の条件ですが、発現がやや低いことがあります。添加量を増やすことをお勧めいたします。
 ※4 :毒性がみられない場合、添加量を増やすことでより多くの発現がみられることがあります。

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Q.遺伝子導入試薬添加後に培地交換する必要はありますか?

培地を交換したほうが細胞に対してのダメージは少なくなるため、培地交換を推奨しています。
培地交換をしない場合の細胞への影響は細胞の種類によって異なります。特に培地交換が必要ない細胞もあるようです。

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Q.血清を含む培地を使ってもよいとありますが、無血清培地を使うとさらに導入効果は高まりますか?

DNAとMultiFectamと複合体を用意する場合は無血清培地と混合する必要がありますが、細胞の培地に関しては無血清培地と血清入り培地での導入効果には大きな違いは認められませんでした。
また今までの試薬で抗生物質を抜いていたのであればMultiFectamでも同じように抜いてください。今までのリポフェクション試薬で、抗生物質存在下でも毒性がなかった細胞株であれば、MultiFectamでも毒性はほとんど出ないと思われます。

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Q. DNAを溶解する溶液として20mM Tris-HClが推奨されていますがTE(Tris/EDTA)では可能ですか?

TEでも問題ありません。EDTAが1mMまで含まれていても阻害がありません。
滅菌水で溶解/希釈することも可能ですが、試薬混合後のpHの変化が起こらないように緩衝液の利用をお薦めします。

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Q. siRNAをTEもしくは滅菌水で溶解して使用することは可能ですか?

可能です。10-20pmol/mlの濃度のsiRNA溶液は、1 pmol/ml になるようにRNaseフリーのTEやOpti-MEM®などの無血清培地で希釈してご利用ください。

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Q. DNA、MultiFectamの複合体調製時にOPTI-MEM®培地の替わりにPBSが使えますか?

PBSを使用すると毒性が強く認められるケースがありますので、お勧めできません。

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Q. 遺伝子を多く導入したい場合には?

DNAと試薬の比率を変えずに液量を変えてみてください。またDNAと試薬の比率を変えてみることで、導入効率が変わる可能性もあるので、お試しください

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Q. 24wellプレート以外では何回分の導入が可能ですか?

下記一覧表をご覧ください。

  サイズ
240μg相当のDNA
サイズ
9000 pmol相当のsiRNA
96-well 25枚分 (2400well分) 23.43枚分 (2250well分)
48-well 25枚分 (1200well分) 23.43枚分 (1125well分)
24-well 20枚分 (480well分) 18.75枚分 (450well分)
12-well 20枚分 (240well分) 18.75枚分 (225well分)
6-well 16枚分 (96well分) 15枚分 (90well分)
35 mm 120枚分 112.5枚分
60 mm 48枚分 45枚分
100 mm 24枚分 N/A

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Q. ・どんな細胞での実施例がありますか?

多くの細胞で、従来の試薬と同等もしくはそれ以上の効率で遺伝子が導入可能です。
ユーザー様からの情報も含めて実績のある細胞の一覧表をご用意しています。

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