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プロメガ製品 Q & A 【 PureYield Midi & Maxi 】

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PureYield Midi/Maxi

Q. PureYield Plasmid精製キットを使った期待されるプラスミドの収量はどれくらいですか?

Q. 精製のためには、どんな真空ポンプや装置が必要ですか?

Q. 溶出操作の際に加えたNuclease Free Waterより回収したDNAの液量が少なくなりました。原因として何が考えられますか?

Q. 実験の都合上、より高濃度のPlasmid DNAが必要なのですが、推奨する濃縮方法はありますか?

Q. 精製後のPlasmid DNAはどのような実験に使用することができますか?

Q. プロトコル以外に、Plasmid DNAの精製操作で注意することはありますか?

Q. A260/A230の値が、2.0以下になってしまう。

[ 解 答 ]

PureYield Midi/Maxi

Q. PureYield Plasmid精製キットを使った期待されるプラスミドの収量はどれくらいですか?

A. PureYield™ Plasmid Maxiprep System (Cat.# A2392, A2393) は、高コピーのプラスミドの場合、250mlの培養から最大1mgの高純度(A260/A280 >1.7)のプラスミドの精製が期待されます。
PureYield™ Plasmid Midiprep System(Cat.# A2492, A2495) は、高コピーのプラスミドの場合、50mlの培養(O.D.600 × 培養液量=100-200) から100-200μgの高純度(A260/A280 >1.7)のプラスミドの精製が期待されます。

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Q. 精製のためには、どんな真空ポンプや装置が必要ですか?

A. 吸引圧が650mmHg(25.6 inches Hg)程度の真空ポンプが利用できます。たとえば、Welch Vacuum Pump (Gardner Denver Welch Vacuum Technology).などが利用可能です。
サーモフィッシャー Cat.#2522C-05

その他、バキュームマニフォールドが必要です。20ポート用のVac-Man® Laboratory Vacuum Manifold (Cat.# A7231),と2ポート用のVac-Man® Jr. Laboratory Vacuum Manifold (Cat.# A7660)を利用してください

セットの方法やその他の付属品に関しては、下記リンク先をご参照ください。
http://www.promega.co.jp/jp/jp_tech/FAQs/Q&A_vacman.htm


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Q. 溶出操作の際に加えたNuclease Free Waterより回収したDNAの液量が少なくなりました。原因として何が考えられますか?

A. 原因は2つ考えられます。

1)PureYieldTM Binding Columnのメンブレンを洗浄時に乾かしすぎた場合、溶出に使用した液がカラムに残存するため、溶出量が少なくなってしまいます。Midiタイプの場合、600μlの溶出液を加えて、400μl程度の液が回収されます。

2)アングルローターを使用して溶出操作を行うと、カラムに液体が残存します。マニュアルに記載してある通りに、スイングローターを使用して溶出ください。

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Q. 実験の都合上、より高濃度のPlasmid DNAが必要なのですが、推奨する濃縮方法はありますか?

A. Eluator™ Vacuum Elution Device (カタログ番号A1071) を用いた吸引法で行うことでより高濃度のPlasmid DNAを得ることができます。
http://www.promega.com/resources/multimedia/dna-and-rna-purification/eluator-vacuum-elution-device-video/

また下記プロトコールに従ってエタノール沈殿を行う方法もあります。

  1. Plasmid DNA溶液に対し、0.05倍量の7.5M酢酸アンモニウムと2.5倍量の95%エタノール溶液を加える。
  2. よく混合したのち、14,000×g, 15分間、室温(20~25℃)で遠心する。
  3. 注意深くピペットで上清を除き、1~2mlの70%エタノール溶液をペレットに加え(ペレットの洗浄)、14,000×g, 5分間遠心する。
  4. 注意深くピペットで上清を除いたあと、3~5分間風乾し、残ったエタノールを蒸発させる。
  5. 残ったペレットをNuclease Free Water(またはTE)に溶解させる。

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Q. 精製後のPlasmid DNAはどのような実験に使用することができますか?

A. 次のようなアプリケーションで使用が確認できています。

  • 培養細胞へTransfection (HeLa 細胞など)
  • in vitro 転写翻訳(弊社のTNT® Systemを使用)
  • 蛍光シークエンスの鋳型DNAとして使用

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Q. プロトコル以外に、Plasmid DNAの精製操作で注意することはありますか?

A. 以下の3点について、注意してください。

1)大腸菌の培養液は、調製後の新鮮なLB培地を使用し、リッチな培地(TF培地など)は避けてください。また、培養後はすぐにPlasmid DNAの精製操作を行ってください。

2)大腸菌の培養は、12-16時間の範囲をお薦めしています。24時間以上の培養を行わないでください。

3)PureYield™ Binding Columnの洗浄からPlasmid DNA溶出までの操作で、Column Wash Solutionの除去が不十分な場合、溶出時のPlasmid溶液にエタノールが混入します。エタノールが混入したPlasmidは、DNAの純度が低く、以降の実験に影響を及ぼします。また、逆にPureYield(TM)TM Binding Columnのメンブレンを乾かしすぎると、Plasmid DNA溶液の溶出量が少なくなります。

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Q. A260/A230の値が、2.0以下になってしまう。

A. Endotoxin Removal Washに含まれるグアニジン塩の混入が考えられます。Endotoxin Removal Washが、完全にカラムを通過したのちにColumn Washを添加し、確実にグアニジン塩を洗い流すようにしてください。

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