プロメガ製品 Q & A 【 RNAi 関連製品 】


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RNAi 関連製品

Q. プロメガで取り扱っているRNAi(short interfering RNA)関連製品には、どのようなものがありますか?

 

GeneClip™ U1 Hairpin Cloning System

Q. GeneClip™の使用方法を教えてください。

Q. GeneClip™ に使用するオリゴヌクレオチドに必要な条件は何ですか?

 

psiCHECK™ Vectors

Q. psiCHECK™ Vectorsとはどのようなベクターですか?

Q. psiCHECK™ Vectorの使用方法を教えてください。

Q. psiCHECK™ Vectorsは従来法と比較してどのような利点がありますか?

Q. 目的遺伝子をpsiCHECK™ Vectorsに導入する際、フレームを考慮する必要がありますか?

Q. 目的遺伝子は必ず全長をベクターに導入する必要がありますか?

Q. psiCHECK™ Vectorはどのようなタイミングで細胞に導入しますか?

Q. psiCHECK™ Vectorsで選択したsiRNAは内在性の遺伝子産物も抑制できますか?

Q. psiCHECK™ Vectorを用いて、プロメガで発現抑制を確認したsiRNAの配列にはどのようなものがありますか?

 

MiCheck miRNAバイオセンサークローン

Q. MiCheck miRNAバイオセンサークローンの使用方法を教えて下さい

Q. ターゲット配列はベクターのどの部分に入っていますか?

 

RNAi 関連製品

プロメガで取り扱っているRNAi(short interfering RNA)関連製品には、どのようなものがありますか?

次のような製品の取り扱いがあります。

siRNAの調製

in vitro合成で siRNAを調製します。
・in vitro siRNA合成システム : T7 RiboMAX™ Express RNAi System
細胞内でsiRNAを作るためのベクタータイプのシステムです。
・クローニングベクタータイプ : GeneClip™ U1 Hairpin Cloning System

RNAiの評価

siRNAの抑制効果を評価します。
・RNAi効果モニタリング、評価用ベクター : siCHECK™ Vectors

siRNA配列の選択

目的遺伝子の発現抑制に効果的なsiRNA配列を選択します。

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GeneClip™ U1 Hairpin Cloning System

GeneClip™の使用方法を教えてください。

  1. 製品プロトコール(Technical Manual #TM256 )のガイドに従い、RNAiの配列がヘアピン構造をとるようにループ配列も含めて、センス鎖、アンチセンス鎖となる2本のオリゴヌクレオチドを合成します。
  2. 合成した2本のオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、ベクターに導入します。
  3. 目的の配列がベクターに導入されたかどうかは、制限酵素のPst I で切断することで、確認できます。ベクター本体には、1箇所のPst Iサイトがありますが、インサートが導入されることで、Pst Iサイトがもう一つ追加されます。従ってインサートを含むベクターは、電気泳動で2本のバンドが、インサートが無ければ、ベクターサイズの1本のバンドしか確認できません。この違いを用いてインサートの有無を簡単に確認できます。

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GeneClip™ に使用するオリゴヌクレオチドに必要な条件は何ですか?

一般的な脱塩グレードのオリゴヌクレオチドを使用してください。

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psiCHECK™ Vectors

psiCHECK™ Vectorsとはどのようなベクターですか?

psiCHECK™ Vectorsは、ルシフェラーゼ発光を利用したsiRNA抑制効果評価用ベクターです。
psiCHECKベクターのウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の3’末端に目的遺伝子を導入し、siRNAと一緒に細胞内に導入します。導入したsiRNAの抑制効果があれば、目的遺伝子に加え、ウミシイタケルシフェラーゼのmRNAが分解されるため、ウミシイタケルシフェラーゼの発光値は抑えられます。逆に抑制効果がなければ、ウミシイタケルシフェラーゼが発現し、発光値が上昇します(フローチャート)。

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psiCHECK™ Vectorの使用方法を教えてください。

psiCHECK™-1 VectorとpsiCHECK™-2 Vectorがあり、どちらもウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の3’末端のマルチクローニングサイトに目的遺伝子を導入します。2つベクターの使い分けは次のようになります。

psiCHECK™-1 Vectorは、生細胞アッセイが可能なEnduRen™ Live Cell Substrateと組み合わせて、siRNAによる抑制効果のタイミングを経時的に観察することができます。Technical Bulletin, #TB329 のFigure 2 の結果をご参照ください。

psiCHECK™-2 Vectorは、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子とトランスフェクション効率の補正用に使用するホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むベクターです。Dual-Luciferase® Reporter Assay SystemDual-Glo™ Luciferase Assay System と組み合わせてアッセイすることで、siRNAによる抑制効果とトランスフェクション効率の補正を同時に行うことができます。Technical Bulletin, #TB329 のFigure 3 の結果をご参照ください。

 

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psiCHECK™ Vectorsは従来法と比較してどのような利点がありますか?

現在、siRNA配列の選択には、様々なアルゴリズムを用いたsiRNAのスクリーニング用プログラムがございます。しかし、プログラムで選択した配列でも実際の実験で抑制効果を確認しなければなりません。従来の抑制効果の評価方法には、GFPの蛍光変化を利用する方法、形態変化の確認やRT-PCR法などがございますが、これらの方法では、評価に時間がかかります。また、ウエスタンブロット法もよく使用される評価方法ですが、抗体のない新規遺伝子には対応できず、siRNAの評価系として十分とはいえません。

これに対して、psiCHECK™ Vectorsは、ウミシイタケルシフェラーゼの発光を利用した新しいsiRNA配列の評価方法です。この方法では、簡便にsiRNA抑制効果の定量的な評価結果が得られます。

 

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目的遺伝子をpsiCHECK™ Vectorsに導入する際、フレームを考慮する必要がありますか?

siRNAの評価は、mRNAレベルでの解析になりますので、フレームを合わせる必要はございません。

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目的遺伝子は必ず全長をベクターに導入する必要がありますか?

全長を導入することをお薦めします。しかし、クローニングに支障が生じるほど遺伝子が長い場合は、その一部でも差し支えございませんが、検討したいsiRNA配列に対応する配列が全て含まれるように導入してください。

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psiCHECK™ Vectorはどのようなタイミングで細胞に導入しますか?

一過性の発現系でアッセイする場合は、siRNAやsiRNA発現ベクターと同時に細胞に導入します。

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psiCHECK™ Vectorsで選択したsiRNAは内在性の遺伝子産物も抑制できますか?

抑制できます。プロメガでは、psiCHECK™ Vectorを使用して選択したsiRNAをHEK-293T やHeLa 細胞に導入して、内在性のp53とcaspase-3遺伝子の発現が抑制されていることをウエスタンブロットで確認しています。

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psiCHECK™ Vectorを用いて、プロメガで発現抑制を確認したsiRNAの配列にはどのようなものがありますか?

プロメガで使用したウミシイタケルシフェラーゼとp53のsiRNA配列は以下になります。これらの配列を用いた実験結果に関しましては、Technical Bulletin, #TB329 のFigure 2、3をご参照ください。

ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子 siRNA配列 : GGCCTTTCACTACTCCTAC

p53 遺伝子siRNA配列 (target site 4) : GAGCACTGCCCAACAACAC

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MiCheck miRNAバイオセンサークローン

MiCheck miRNAバイオセンサークローンの使用方法を教えて下さい

プロメガのレポーターアッセイ試薬Dual-Luciferase® Reporter Assay System やDual-Glo™ Luciferase Assay System と組み合わせてアッセイできます。 上記のQ&A「psiCHECK™ Vectorの使用方法を教えてください。」をご参照ください。
下記文献にて使用例が記載されております。
Reduction of Type IV Collagen by Upregulated miR-29 in Normal Elderly Mouse and klotho-Deficient, Senescence-Model Mouse
Variation of gene silencing involving endogenous microRNA in mammalian cells

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ターゲット配列はベクターのどの部分に入っていますか?

psiCHECK™-2 Vector(カタログ番号:C8021)のhRlucの3'側にあるマルチクローニングサイトのXhoI-PmeIサイトにターゲット配列が挿入されています。(ターゲット配列挿入によりPmeIサイトはつぶれているため、本サイトは利用できません)

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