TGFβ1 Emax™ImmunoAssay System

カタログ番号  G7591

※この説明書は簡易型の日本語マニュアルです。詳細については
TTechnical Bulletin No.196をご覧ください。

もくじ

  1. サンプル調整
  2. ELISAプレートの作成
  3. スタンダードカーブの調整
  4. ELISAの実施
所要時間

1.5日

必要な試薬
  • carbonate coating buffer
  • TBST wash buffer
  • 1M phosphoric acid
必要な機具/機器
  • 96ウエル平底ELISAプレート
  • plate sealer
  • マイクロプレートリーダー(450nm)
  • (マルチチャンネル)ピペッター
  • ELISA洗浄機(の使用が望ましい)
  • プレート振とう機(の使用が望ましい)
一般的注意事項
  • 本製品は研究用でり、診断用ではありません。
  • スタンダードカーブを外れた値は有効ではありません。
  • 正確な値を出すために、サンプルの希釈にはTGFβ Sample 1X Bufferを使用して下さい。
  • 購入後、3ヶ月以内に使用してください。
  • クエン酸を含む血漿は定量に影響を与える可能性があります。
  • 作成中/後のプレートのウエル表面を傷つけないように十分注意してください。
  • ELISAプレートは正確性を上げるために高品質のものをお使いください。
    [例]CostarR(Cat#3590)、Nunc MaxiSorp?(Cat#439454)、DYNEX ImmulonR--4(Cat#011-010-3855)など
  • 本システムは重炭酸ナトリウムバッファーで最適化しています。他のバッファーの使用は避けてください。
  • 抗体を希釈する場合泡立ちを防いでください。
  • 各操作中、ウエルを完全に乾燥させないでください。
  • ピペッティング、洗浄などの手技の安定性に留意してください。

戻る日本語ホーム日本語マニュアルもくじ

サンプルの調製

btn_003.gif (1229 バイト)サンプルの取り扱い

 適応するサンプル:組織培養上澄み・血漿・血清・尿(抗凝固剤としてEDTAを使用すれば、血小板の分解を防ぐことができます。)
 サンプルを保存する場合は-20℃で凍結し、凍結/融解を繰り返さないで下さい。残さなどは遠心で除いてください。
 血清/血漿中(表1参照)の内因性TGFβ2や結合タンパク質により初期希釈率を下記のように調整することをおすすめします。

  • 10%ウシ胎児血清を含むサンプル → TGFβ Sample 1X Bufferで16倍希釈
  • ヒト血清あるいは血漿 → TGFβ Sample 1X Bufferで150倍希釈

表1.様々な動物種における血清中内在性TGFβ1レベル

動物種 ng/ml 動物種 ng/ml
ウシ(成体) 30 ヒト 20
ウシ(胎児) 17 サル 60
ニワトリ 0.5 マウス 125
ヤギ 12 ブタ 21
ウマ ラット 28


btn_003.gif (1229 バイト)酸処理について

 TGF-β1はin vivoで潜在型から成熟型にプロセシングを受けます。Anti- TGF-β1 mAb/pAbは成熟型のみを認識すします。in vitroではこのプロセシングを酸処理で代用することができます。この処理はサンプル中の総TGF-β1を検出する方法なので、成熟TGF-βのみの検出には施さないでください。また、キットに添付のTGF-β1 Standardは酸処理を施さないでください。

酸処理方法

1)サンプルをDPBS で5倍に希釈

2)希釈サンプル50μlに1N HClを1μl加え、pHが2.0~3.0であることを確認

3)攪拌し、室温で15~20分インキュベート

4)1N NaOHを1μl加えpHが約7.5であることを確認

  • 上記のHCl/NaOH添加量は1つの目安で、サンプルの種類により異なります。pHペーパーで確認してください。(血清/血漿の場合は希釈前に1mlあたり1N HClを110-125μl加えます。)
  • サンプル中のキャリアタンパク質が少ない場合、TGF-β1をロスするおそれがあるので、適量のキャリアタンパク質を含むTGFβSample 1X Bufferで希釈する必要があります。
  • タンパク質含量が低いサンプル(尿など)については直接 酸/中和処理を行い、必要に応じてTGFβ Sample 1X Bufferで希釈することをおすすめします。
  • サンプルは前もって酸処理を行い、-20℃あるいは-70℃で保存することができます。
DPBS (1Lあたりの組成
0.2g   KCl 1.15g Na2HPO4
8.0g   NaCl 654μl 1M MgCl2・6H2O
0.2g   KH2PO4 905μl 1M CaCl2・2H2O

1N HCl/1N NaOHでpH7.35に調整する

戻る日本語ホーム日本語マニュアルもくじ

ELISAプレートの作成

1日目

I.TGF-β Coat mAbのコーテイング

Anti-TGF-β Coat mAb 10μl
Carbonate coating buffer 10ml

1液(96ウエル分) 10ml強

1)ELISAプレートの各ウエルに?液100μlを添加

2)plate sealerでプレートをシールし、インキュベート4℃、 14-18時間

carbonate coating bufferの組成

25mM sodium bicarbonate
25mM sodium carbonate
pH 9.7 (1N HCl/1N NaClで調整)

2日目

II. Block 1 X bufferの調製とウエルのブロッキング

TGFβ Block 5X Buffer 5.6ml
DDW 22.4ml

2液(Block 1X buffer/96ウエル分) 28.0ml

1)前日のプレートを室温に戻す(約10~15分)

2)余分な1液(pAb溶液)を捨てる

3)プレートの各ウエルに2液(Block 1X buffer)270μlを添加

4)Plate sealerでプレートをシールし、37℃で35分間インキュベート(振とうしない)

5)洗浄操作:TBSTで5回洗浄

(1. 内容物を捨てた後、TBSTを各ウエルに満たす。2. プレートを激しく振り下げ、 研究室の"流し"にTBSTを捨てる。3. ペーパータオル上にプレートを伏せ、3回たたき液体をきる)この操作を合計5回くりかえす。

6)ELISAプレートの完成

戻る日本語ホーム日本語マニュアルもくじ

スタンダードカーブ調製
TGFβ Sample 10X Buffer 2.3ml
DDW 20.7ml

3液(TGFβ Sample 1X Buffer/96ウエル分) 23ml

 

TGFβ1 Standard 4μl (1μg/ml)
TGFβ Sample 1X buffer 3996μl

上記を 混合 (1000倍希釈液) 4000μl (1000pg/ml)

1000倍希釈液から2倍希釈系列を作成(1000pg/ml~15.6pg/ml, 0pg/ml)

2つの縦列をスタンダードカーブに使用します。

1)各2列のB~HにウエルあたりTGFβ Sample 1X buffer 100μlを添加

2)各2列のAにウエルあたり1000倍希釈液(1000pg/ml)200μlを添加

3)各2列のAからBに100μl加え、次にBからCに100μl(これをGまで繰り返し、Hには加えない)

戻る日本語ホーム日本語マニュアルもくじ

ELISAの実施

I. サンプルの添加

テストサンプルはまず4倍に希釈します(血清/血漿/培地については前述の"サンプルの取り扱い"を参照下さい)。1列ごとに2倍希釈系列を作り、スタンダードカーブから外れにくくすることをおすすめします。サンプル濃度を1ポイント(トリプリケイト)で直接測定し、陽性サンプルについては、正確な濃度を出すために再測定する方法もあります。

注意:サンプルの調製液のみをネガティブコントロールとして測定することをおすすめします。

1)各ウエルに100μlのサンプルを添加(素早く行い、液体の蒸発を防ぐ)

2)Plate sealerでプレートをシールし、1.5時間、室温で振とう(500±100rpm)しながらインキュベート(振とうを行わないと、感度が落ちることが予想されます。)

3)洗浄操作 (上記洗浄操作参照)

II. Anti-Human TGFβ1 pAbの添加

Anti-TGFβ1pAb 10μl
TGFβSample 1X Buffe 10ml

1000倍希釈液(96ウエル分) 10ml強

1)上記を各ウエルに100μl添加

2)Plate sealerでプレートをシールし、2時間、室温で振とうしながら(500±100rpm)インキュベート

3)洗浄操作(上記洗浄操作参照)

III. TGF β HRP Conjugateの添加

TGFβ HRP Conjugate 100μl
TGFβSample 1X Buffe 9.9ml

100倍希釈液(96ウエル分) 10ml

1)上記を各ウエルに100μl添加

2)2時間、室温で振とうしながら(500±100rpm)インキュベート

3)洗浄操作 (上記洗浄操作参照)

IV. 発色:TMB One Solution の添加

1)TMB One Solution(室温)を各ウエルに100μl添加

2)15分間、室温でインキュベート (青色に呈色)

3)1)と同じ順番で1N 塩酸を各ウエルに100μl添加し反応停止 (黄色に呈色)

4)反応停止後30分以内にプレートリーダーで吸光度測定(450nm)

戻る日本語ホーム日本語マニュアルもくじ