GDNF Emax™ ImmunoAssay System

カタログ番号  G7621/G7620

※この説明書は簡易型の日本語マニュアルです。詳細については
Technical Bulletin No.221をご覧ください

もくじ

  1. サンプル調整
  2. ELISAプレートの作成
  3. スタンダードカーブの調整
  4. ELISAの実施
  5. トラブルシューティング
所要時間

2.5日

必要な試薬
  • carbonate coating buffer
  • TBST wash buffer
  • 1M phosphoric acid
必要な機具/機器
  • 96ウエル平底ELISAプレート
  • plate sealer
  • マイクロプレートリーダー(450nm)
  • (マルチチャンネル)ピペッター
  • ELISA洗浄機(の使用が望ましい)
  • プレート振とう機(の使用が望ましい)
一般的注意事項
  • 本製品は研究用であり、診断用ではありません。
  • スタンダードカーブを外れた値は有効ではありません。
  • 正確な値を出すために、サンプルの希釈にはBlock & Sample 1X Bufferを使用して下さい。
  • 購入後、3ヶ月以内に使用してください。
  • クエン酸を含む血漿は定量に影響を与える可能性があります。
  • 作成中/後のプレートのウエル表面を傷つけないように十分注意してください。
  • ELISAプレートは正確性を上げるために高品質のものをお使いください。
    [例]Nunc MaxiSorp™(Cat#439454)、Dynatech Immulon
    ®-4(Cat#011-010- 3855)など
  • 本システムは重炭酸ナトリウムバッファーで最適化しています。他のバッファーの使用は避けてください。
  • 各操作中、ウエルを完全に乾燥させないでください。
  • 抗体を希釈する場合泡立ちを防いでください。
  • ピペッティング、洗浄などの手技の安定性に留意してください。

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サンプルの調製
  • サンプルの取り扱い

適応するサンプル:組織培養上澄み・血漿・血清・組織溶解液
サンプルを保存する場合は-20℃で凍結し、凍結/融解を繰り返さないで下さい。残さなどは遠心で除いてください。

  • 細胞溶解

下記のlysis bufferで調製できます。

 Lysis bufferの組成
137mM  NaCl 1mM  PMSF
20mM  Tris 10μg/ml  aprotinin
1%  NP40 1μg/ml  leupeptin
10%  glycerol 0.5mM  sodium
 vanadate
  • 酸処理について

酸/中和処理により抽出サンプル中のGDNF検出量が増加することが期待できます。この処理による増感のメカニズムは、リガンドとレセプターとの相互作用が壊れることによるものと考えられています。しかし、この効果は動物種/組織によっても異なり、場合によってはこの処理が感度を下げることもあるので、前実験でその効果を確認する必要があります。この処理はサンプル中の総GDNFの検出量を上げる方法なので、フリーの成熟GDNFのみの検出には施さないでください。また、キットに添付のGDNF Standardにも酸処理を行わないでください。

btn_004.gif (574 バイト)酸処理

1)サンプルをDPBS で5倍に希釈

2)希釈サンプル50μlに1N HClを1μl加え、pHが2.0~3.0であることを確認

3)攪拌し、室温で15~20分インキュベート

4)1N NaOHを1μl加えpHが約7.5であることを確認

  • 上記のHCl/NaOH添加量は1つの目安で、サンプルの種類により異なります。pHペーパーで確認してください。(血清/血漿の場合は希釈前に1mlあたり1N HClを110-125μl加えます。)
  • サンプル中のキャリアタンパク質が少ない場合、GDNFをロスするおそれがあるので、適量のキャリアタンパク質を含むBlock & Sample 1X Bufferで希釈する必要があります。
  • タンパク質含量が低いサンプル(血清不含培地など)については直接 酸/中和処理を行ってから、Block & Sample 1X Bufferで希釈することをおすすめします。
  • サンプルは前もって酸処理を行い、-20℃あるいは-70℃で保存することができます
 DPBS(1Lあたり)の組成
0.2g  KCl 1.15g  Na2HPO4
8.0g  NaCl 133mg  CaCl2・2H2O
0.2g  KH2PO4 100mg  MgCl2・6H2O

※1N HCl/1N NaOHでpH7.35に調整

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ELISAプレートの作成

1日目

I. Anti-GDNF pAbのコーティング

Anti-GDNF mAb                     10μl

Carbonate coating buffer   10ml

①液(mAb 溶液/96ウエル分) 10ml 強

 Carbonate coting bufferの組成
25mM sodium bicarbonate
25mM sodium carbonate
pH8.2 (1N HCl/1N NaCl)

1)ELISAプレートの各ウエルに①液(mAb 溶液)100μlを添加

2)plate sealerでプレートをシールし、インキュベート4℃、 16-20時間

2日目

II. Block & Sample 1X bufferの調製とウェルのブロッキング

5 X Block & sample buffer           8.6ml
DDW                     34.4ml

②液(1X Block & sample buffer/96ウエル分) 43.0ml

 

1)前日のプレートから余分な①液(mAb溶液)を捨てる

2)TBST wash bufferでウエルを洗浄

3)余分なTBST wash bufferを捨てる

4)プレートの各ウエルに②液200μlを添加

5)インキュベート室温(22-25℃)1時間(振とうしない)

6)余分な②液(Block & sample 1X buffer)を捨てる

7)TBST wash bufferでウエルを洗浄

8)余分なTBST wash bufferを捨てる

9)ELISAプレートの完成

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スタンダードカーブ調製

GDNF スタンダード                           2μl(2μg/ml)
Block & sample 1Xbuffer                           3998μl

上記を 混合 (2000倍希釈液) 4000μl(1000pg/ml)

2000倍希釈液から2倍希釈系列を作成(1000pg/ml~15.6pg/ml, 0pg/ml)
2つの縦列をスタンダードカーブに使用します。

1)各列のB~HにウエルあたりBlock & Sample 1X Buffer 100μlを添加

2)各列のAにウエルあたり2000倍希釈液(1000pg/ml)200μlを添加

3)各列のAからBに100μl加え、次にBからCに100μl(これをGまで繰り返し、Hには加えない)

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ELISAの実施

I. サンプルの添加

テストサンプルはまず2倍に希釈します。1列ごとに2倍希釈系列を作り、スタンダードカーブから外れにくくすることをおすすめします。サンプル濃度を1ポイント(トリプリケイト)で直接測定し、陽性サンプルについては、正確な濃度を出すために再測定する方法もあります。
注意:サンプルの調製液のみをネガティブコントロールとして測定することをおすすめします。

1)各ウエルに100μlのサンプルを添加(素早く行い、液体の蒸発を防ぐ)

2)Plate sealerでプレートをシールし、6時間、室温で振とう(500rpm)しながらインキュベート(振とうを行わないと、感度が落ちることが予想されます。)

3)洗浄操作:TBST wash bufferで5回洗浄
(①内容物を捨てた後、TBSTを各ウエルに満たす。②プレートを激しく振り下げ、研究室の"流し"にTBSTを捨てる。③ペーパータオルの上にプレートを伏せ、3回たたき液体をきる)この操作を5回くりかえす。

II. Anti-HumanGDNF pAbの添加

Anti-GDNF pAb                           20μl
Block & Sample 1X Buffer     10ml

500倍希釈液(96ウエル分)       10ml 強

1)上記500倍希釈液を各ウエルに100μl添加

2)Plate sealerでプレートをシールし、16-20時間、4℃(振とうしない)でインキュベート

3日目

III. Anti-Chicken IgY HRPの添加

Anti-Chicken IgY   HRP                   2μl
Block & Sample 1X Buffer            10ml

500倍希釈液(96ウエル分)        10ml 強

1)TBST wash bufferで5回プレートを洗浄[I.-3)を参照]

2)5000倍希釈液を各ウエルに100μl添加

3)2時間、室温で振とう(500±100rpm)しながらインキュベート
※この間に発色用酵素基質の調製を行う。

4)TBSTで5回洗浄[I.-3)を参照]

IV. 発色反応

TMB Solution                      5ml
Peroxidase Substrate        5ml

酵素基質液(96ウエル分) 10ml

  • 発色反応の約1時間前に調製してください。
  • 遮光して、使用時までに室温にもどしてください。

注意:TMB Solution, Peroxidase Substrate, 1M phosphoric acidは皮膚、目に付けないでください。

 1M phosphoric acidの調製
1Lの脱イオン水に67.6mlの85%(14.8M) phosphoric acidを加える。

1)酵素基質液を各ウエルに100μl添加

2)約10~15分間、室温でインキュベート(振とうしない)
※青色を呈してきます。特にスタンダードの発色に留意してください。

3)1M phosphoric acidを100μl添加し、反応を停止
※反応液が酸性になり青色から黄色に変ります。

4)反応停止後1時間以内にプレートリーダーで吸光度(450nm)を測定します。

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トラブルシューティング
症状 主な原因 コメント
サンプルの吸光度がスタンダ-ドカ-ブの上限を超えている。 サンプル中のGDNFが極めて高力価である。 サンプルを希釈する
希釈系列を変えてスタンダ-ドカ-ブ内に入る様にする。
サンプルの吸光度がスタンダ-ドカ-ブの下限を下回っている。  サンプル中のGDNFが極めて低力価である。サンプルを希釈し過ぎている。 サンプルの希釈率を下げて再測定する。
すべてのサンプルの吸光度が高い。 発色反応が早すぎる プレートリーダーのダイナミックレンジを超えている場合は発色時間を短くする。
抗マウスIgG、HRP標識抗体の希釈率を上げる。
ダイナミックレンジの広いプレートリーダーを使う。
すべてのサンプルの吸光度が低い。 溶液の希釈が間違っている。 試薬類の希釈率を再度確認する。
GDNF Standardの失活 保存条件が不適切 GDNF Standardは原液を4℃で保存した場合、購入後3ヶ月安定
レプリケ-トサンプルで測定値がばらつく。 実験手技の問題 停止液を発色基質液と同じ順番にウエルに添加する。
各試薬添加時にピペットチップを換える。
実験するサンプル数を増やす。
ピペットのキャリブレ-ションを行なう。
洗浄操作を確実に行う。

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