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プロメガ製品 Q & A 【 レポーターアッセイ② 】

 

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【レポーターアッセイ 一般】

Q. プロメガのレポーター酵素の安定性、分子量、基質、および感度はどのようになっていますか。

Q. ホタルルシフェラーゼとウミシイタケルシフェラーゼの発光波長はどのくらいですか?

Q. なぜプロモーターエレメントを解析するときに、2つの異なるレポーターベクターがトランスフェクション実験に使われるのですか。

Q. 測定機器は何を使えばよいでしょうか?

Q. ルシフェラーゼの発光測定に適したプレートやチューブは何ですか?


【pGL4 ルシフェラーゼレポーターベクター】

Q. pGL4 Vectorの特徴を教えてください。

Q. pGL4.10[luc2] VectorはpGL3-Basic Vectorと比較して、どのような特徴があるのですか?

Q. ホタルルシフェラーゼ遺伝子をもつpGL4 .1シリーズのベクターはどのように使い分けるのですか?

Q. pGL4.10[luc2] Vectorに挿入した配列のシークエンスを確認したいのですが、どのレポーターベクター用プライマーが使用できますか?

Q. pGL4.7 Vectors はpRL Vectors、phRL Vectorsと比較して、どのような特徴があるのですか?

Q. ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子をコードするpGL4 .7シリーズのベクターはどのように使い分けるのですか?

Q. ホタルルシフェラーゼ発現に対する内部標準に使用するにはどのベクターが良いのでしょうか?

Q. ルシフェラーゼ遺伝子の下流にタンパク質分解配列のCL1やPESTを含むレポーターベクター(pGL4.11[luc2P]、pGL4.12[luc2CP]、pGL4.71[hRlucP]、pGL4.72[hRlucCP])は、通常のレポーターベクター(pGL4.10[luc2]やpGL4.70[hRluc])に対して、どのような特徴を示しますか。

Q. どのような原理で応答性が上がるのですか?

Q. 他のレポーターに比べて、Rapid Response Reporter Vectorsの発現量と半減期はどのようになっていますか?

Q. minPとは、何ですか?

Q. minPが導入されたベクターはどのようなアッセイに利用されますか?

Q. minPの由来は何ですか?

Q. minP導入済みベクターpGL4シリーズは、どのような製品がありますか?

Q. 現在販売されているpGL4ベクター(転写因子応答配列+minP)以外に今後販売する予定はありますか?

Q. minPを用いる利点は何ですか?

Q. GloResponse™ Luciferase Reporter Cell Linesとは何ですか?

Q. GloResponse™ にはどのような製品がありますか?

Q. 安定発現株を自作するのと比較して、GloResponse™を使うことの利点は何ですか?

Q. GloResponse™の培養条件を教えてください。

Q. コントロールになる薬剤はありますか?

Q. GloResponse™ を注文する際の注意点を教えてください。


【その他のルシフェラーゼレポーターベクター】

Q. pGL3 Basic VectorのマルチクローニングサイトのXho I が消化されにくい場合があるのはなぜですか?また、その対処法は何ですか?

Q. プロメガのLuciferase Reporter Vector - pGL3はpGL2 とどこが違うのですか。

Q. pGL2とpGL3ではルシフェラーゼの発現量にどの程度の差がありますか?

Q. pGL2またはpGL3-Control, -Basic, -Promoter, -Enhancer Vectorのルシフェラーゼの発現量は、どの程度違いますか?


【シングル ルシフェラーゼ定量システム】

Bright-Glo™, Steady-Glo®, Luciferase Assay System, Renilla Luciferase Assay system


【デュアル ルシフェラーゼ定量システム 】

Q. ウミシイタケルシフェラーゼの活性は、ホタルルシフェラーゼの活性とどのような違いがありますか? また、2つのレポーターベクターの共トランスフェクションにはどのような条件が推奨されますか。

Q. レポータートランスフェクションの結果を標準化することは、なぜ必要なのですか?また、どのような内部標準ベクターを使うのが最も良いですか?

Q. Dual-Liciferase® Reporter Assay SystemとDual-Glo™ Luciferase Assay Systemの違いは何ですか?

Q. ホタルルシフェラーゼとウミシイタケルシフェラーゼの発光半減期はどの程度ですか?

Q. 未開封での保存期間はどのくらいですか? また、調製後の試薬、Luciferase Assay Reagent II
(Luciferase Assay Substrate+Luciferase Assay Buffer II)とStop & Glo® Reagent (Stop & Glo® Substrate+Stop & Glo® Buffer) の保存期間はどのくらいですか?

Q. Luciferase Assay Buffer IIとStop & Glo® Bufferを室温で溶解させた時、析出物が見られますが、問題ありませんか?

Q. Luciferase Assay Reagent IIのかわりに、ホタルルシフェラーゼ定量システムLuciferase Assay System (カタログ番号:E1500) のLuciferase Assay Reagentを使ってDual-Luciferase® Assayはできますか?

Q. ホタルルシフェラーゼとウミシイタケルシフェラーゼの発光値にばらつきが見られます。原因として何が考えられますか?

Q. ルシフェラーゼ活性は、刺激後どのくらいの時期から測定できますか?

Q. シングルチューブタイプのルミノメーターを使用しています。ホタルルシフェラーゼ活性を測定して、その後ウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定することは可能ですか?

Q. 保存期間はどのくらいですか?

Q. Dual-Glo™ Luciferase BufferとDual-Glo™ Stop &Glo® Bufferに析出が見られますが、問題ありませんか?

Q. 96ウェルプレート以外で細胞を培養した場合、どのように測定すればよいですか?

Q. 細胞を凍結保存して後日アッセイできますか?

Q. 添加した刺激物質を除いてから測定したいのですが、培地を捨てて、細胞に直接Dual-Glo™ Luciferase Reagentを加えることは可能ですか?

Q. Dual-Glo™ Luciferase Assay Systemの推奨する発光測定時間はどのくらいですか?


【デュアル カラー・ルシフェラーゼ定量システム】

Q. Chroma-Glo™ Luciferase Assay Systemとは、どのようなシステムですか?

Q Chroma-Glo™ Reporter VectorとChroma-Glo™ Reagent (基質 + 溶解バッファー)で産生される発光の波長を教えてください。

Q. Chroma-Glo™ Reagentにより産生される赤色と緑色の発光シグナルはどのように検出するのでしょうか?

Q. Chroma-Glo™ アッセイ用にフィルターはどこから入手できるでしょうか?

Q. Chroma-Glo™ Luciferase Assay の測定が可能な機器かどうかは何を確認すればよいですか?

Q. Chroma-Glo™ Luciferase Assayにホタルルシフェラーゼアッセイ試薬を使用できますか?

Q. Chroma-Glo™ Reagentの保存期間はどのくらいですか?

Q. 細胞ライセートを用いてChroma-Glo™ Luciferase Assayを行えますか?


【ルシフェラーゼ基質】

Q. EnduRen™ Live Cell Substrateは、レニラルシフェラーゼの一般的な基質であるセレンテラジンとどのように異なりますか?

Q. ホタルルシフェラーゼの基質ルシフェリンも生細胞アッセイに使用できますが、それと比較してEnduren™ の利点は何ですか?

Q. EnduRen™ Live Cell Substrateはどのようなアッセイに使えますか?


 一般

レポーターアッセイ 一般

Q.プロメガのレポーター酵素の安定性、分子量、基質、および感度はどのようになっていますか。

プロメガのホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼおよびクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ(CAT)酵素の安定性、分子量、基質、および感度のデータを以下の表に示します。

表 プロメガのレポーター酵素の安定性・分子量・基質・感度

レポーター酵素 mRNA
半減期
タンパク質
半減期
分子量 基質 感度
ホタル
ルシフェラーゼ

6時間
(1)
3時間
(哺乳類)(1,2)
61kDa
単量体(3)
甲虫ルシフェリン
(1,6)
1fg
(10-20moles)
ウミシイタケ
ルシフェラーゼ

5.3時間
(40℃)(2)
36kDa
単量体(2,4,5)
セレンテラジン
(2,5,8)
10fg
(3X10-19moles)
β-ガラクトシダーゼ 20時間 465kDa 4量体
(各116kDa)(6)
ONPG(2,6) 104~105分子
CAT 6時間(1) 50時間(1) 80kDa 4量体
(各20kDa)(7)
クロラムフェニコール
(6)
5~10X107分子

参考資料:

1. Thompson, J.F. et al. (1991) Gene 103, 171.
2. Bronstein, I. et al. (1994) Anal, Biochem. 219, 169
3. Luciferase Assay System Technical Bulletin #TB101, Promega Corporation.
4. Matthews, J.C. et al. (1977) Biochemistry 16, 85
5. Lorenz, W.W. et al. (1993) In : Bioluminescence and Chemiluminescence John Wiley and Sons, 191.
6. Alam, J. and Cook, J.L. (1990) Anal. Biochem. 188, 245
7. Shaw, V.W. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4438.
8. Lorenz, W.W. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4438

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Q. ホタルルシフェラーゼとウミシイタケルシフェラーゼの発光波長はどのくらいですか?

ホタルルシフェラーゼ:556nm、ウミシイタケルシフェラーゼ:480nmです。

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Q.なぜプロモーターエレメントを解析するときに、2つの異なるレポーターベクターがトランスフェクション実験に使われるのですか。

トランスフェクション効率の違いを標準化するためです。目的のレポーター遺伝子の活性は、発現量が一定の2番目のレポーターベクターの活性をもとに標準化され、ひとつの実験内あるいは実験間の結果の比較を可能にします。Dual-Luciferase® Reporter Assay Systemでは、ウミシイタケのルシフェラーゼ活性によるホタルルシフェラーゼ活性の標準化を行うことができます。

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Q. 測定機器は何を使えばよいでしょうか?

ルミノメーター(発光測定装置)で測定を行います。プロメガでは、シングルチューブタイプの 20/20n Luminometer(カタログ番号:E5311)、96ウエルプレートタイプの GloMax™ 96 Microplate Luminometer(カタログ番号:E6501)をご用意しております。
尚、20/20n Luminometerは、以前、販売していましたTurner BioSystems Luminometer Model TD-20/20(カタログ番号:E2041)の代替機種です。

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Q. ルシフェラーゼの発光測定に適したプレートやチューブは何ですか?

プレートは、白色不透明タイプをお使いください。また、測定方法により、ソリッドプレートかクリアボトムプレートかを選択してください。推奨するプレートを以下にまとめました。

メーカー タイプ 型番 特徴
コーニング・コースター ソリッドプレート 3912 白色 / 平底 / 滅菌未処理
/ フタなし / 表面処理なし
クリアボトムプレート 3610 白色 / 平底 / 滅菌処理済み
/ フタあり / 細胞培養表面処理
ナルジェ・ヌンク ソリッドプレート
(ルミヌンクプレート)
136101 白色 / 平底 / 滅菌処理済み
/ フタあり / 細胞培養表面処理
クリアボトムプレート
(オプチィカルボトムプレート)
165306 白色 / 平底 / 滅菌処理済み
/ フタあり / 細胞培養表面処理
パーキンエルマー ソリッドプレート
(OptiPlate-96)
6005290 白色 / 平底 / 滅菌未処理
/ フタなし / 表面処理なし
クリアボトムプレート
(ViewPlate-96)
6005181 白色 / 平底 / 滅菌処理済み
/ フタあり / 細胞培養表面処理

ソリッドプレート :
透明の培養ディッシュまたは培養プレートで細胞培養し、細胞を溶解後、測定用プレートに移して、測定する場合。
クリアボトムプレート:
細胞培養し、そのまま試薬を加えて測定する場合。

チューブは、ご使用になるルミノメーターで推奨しているチューブをご使用ください。
プロメガの20/20n Luminometer (カタログ番号:E5311)の場合は、1.5mlのポリプロピレン微量遠心チューブと35mm 培養ディッシュがご使用いただけます。

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 pGL4 ルシフェラーゼレポーターベクター

pGL4 Luciferase Reporter Vectors

Q. pGL4 Vectorの特徴を教えてください。

主な特徴を表1に示します。pGL4 Vectorには、レポーターとしてホタルルシフェラーゼもしくはウミシイタケルシフェラーゼがコードされています。

表1. pGL4 Vectorの特徴

製品名 カタログ
番号
レポーター タンパク質
分解配列
哺乳動物細胞用
プロモーター
pGL4.10[luc2] E6651 ホタルルシフェラーゼ なし なし
pGL4.11[luc2P] E6661 PEST なし
pGL4.12[luc2CP] E6671 CL1およびPEST なし
pGL4.13[luc2/SV40] E6681 なし SV40
pGL4.70[hRluc] E6881 ウミシイタケルシフェラーゼ なし なし
pGL4.71[hRlucP] E6891 PEST なし
pGL4.72[hRlucCP] E6901 CL1およびPEST なし
pGL4.73[hRluc/SV40] E6911 なし SV40
pGL4.74[hRluc/TK] E6921 なし TK
pGL4.75[hRluc/CMV] E6931 なし CMV

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ホタルルシフェラーゼ発現ベクター

Q. pGL4.10[luc2] VectorはpGL3-Basic Vectorと比較して、どのような特徴があるのですか?

pGL3-Basic Vectorに対して、pGL4.10[luc2] Vectorでは、以下に示すような改良がなされています。

  1. pGL4で用いられているluc2遺伝子は、pGL3のluc+遺伝子に比べて90%以上の転写因子結合部位が除去されています (図1)。
    ※ アミノ酸配列には変化はありません。
  2. pGL4のベクターバックボーンは、pGL3のベクターバックボーンに比べて78%の転写因子結合部位が除去されています (図2)。
    ※ 1および2の改良により、非特異的な転写が抑制され、優れたシグナル・ノイズ比を実現します。
  3. 哺乳動物での発現に最適化されたコドンにより高い発現効率を示します (図3)。
  4. マルチクローングサイトに新しい制限酵素部位を付加しました (図4)。
  5. Hygromycin耐性遺伝子を含んだ安定発現株作成用ベクターをご用意しております。

pGL4.10[luc2] VectorとpGL3-Basic Vectorの上記の相違点をまとめた表2をご参照ください。

表2. pGL4.10[luc2] VectorとpGL3-Basic Vectorの相違点

  pGL3 pGL4.10
ホタルルシフェラーゼ遺伝子の名称 luc+ luc2
哺乳動物での発現に最適化したコドンへの改変
予測される転写調節因子結合部位の除去 なし ホタルルシフェラーゼ遺伝子
+ ベクターバックボーン
安定発現株作成用ベクター なし pGL4.14[luc2/Hygro]

図1. luc+(pGL3)とluc2(pGL4)の転写因子結合部位

図3. luc+(pGL3)とluc2(pGL4)の発現効率の比較

図2. pGL3とpGL4のベクターバックボーンにおける転写因子結合部位

図4. マルチクローングサイトにおける制限酵素部位の比較

※ pGL4.7シリーズでは、hRluc遺伝子中にBglIとEcoRVが存在するため、これらの制限酵素をクローニングに使用することはできません。

 

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Q. ホタルルシフェラーゼ遺伝子をもつpGL4 .1シリーズのベクターはどのように使い分けるのですか?

表3に示した特長と用途をベクター選択の参考にしてください。

表3. ホタルルシフェラーゼ発現ベクターpGL4.1シリーズの特長と用途

製品名
(カタログ番号)
pGL4.10[luc2]
(E6651)
pGL4.11[luc2P]
(E6661)
pGL4.12[luc2CP]
(E6671)
pGL4.13[luc2/SV40]
(E6681)
プロモーター なし なし なし SV40
タンパク質
分解配列
なし PEST CL1 & PEST なし
安定株作成用
ベクター
(カタログ番号)
pGL4.14
[luc2/Hygro]
(E6691)
pGL4.15
[luc2P/Hygro]
(E6701)
pGL4.16
[luc2CP/Hygro]
(E6711)
なし
用途 一般的な
レポーターアッセイ
短時間に最大の発現誘導率を得る
必要のあるアッセイ※1
陽性コントロール

※1 : pGL4.12[luc2CP] VectorはCL1とPESTを含むため、pGL4.11[luc2P] Vectorよりも低い発光量を示します。

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Q. pGL4.10[luc2] Vectorに挿入した配列のシークエンスを確認したいのですが、どのレポーターベクター用プライマーが使用できますか?

マルチクローニングサイトの上流から解析するプライマーとして、pGL4 .10[luc2] Vectorの4191-4210にアニーリングするRVprimer3 (カタログ番号E4481)をご利用いただけます。
マルチクローニングサイトの下流から解析するプライマーは現在のところ販売しておりません。
そのため、pGL4.10[luc2] Vectorの101-123にアニーリングする下記のオリゴをシークエンス用に合成して、ご利用ください。

pGL4 .10[luc2] Vectorの配列情報

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ウミシイタケルシフェラーゼ発現ベクター

Q. pGL4.7 Vectors はpRL Vectors、phRL Vectorsと比較して、どのような特徴があるのですか?

pRL VectorやphRL Vectorに対して、pGL4.7 Vectorでは、以下に示すような改良がなされています。

  1. pGL4で用いられているhRluc遺伝子は、pRLのRluc遺伝子に比べて90%以上の転写因子結合部位が除去されています (図5)。
    ※ アミノ酸配列には変化はありません。
  2. pGL4のベクターバックボーンは、pGL3のベクターバックボーンに比べて78%の転写因子結合部位が除去されています (図2)
    ※ 1および2の改良により、非特異的な転写が抑制され、優れたシグナル・ノイズ比を実現します。
  3. 哺乳動物での発現に最適化されたコドンにより高い発現効率を示します (図6)。
  4. Hygromycin耐性遺伝子を含んだ安定発現株作成用ベクターを発売しました。

pRL Vector、phRL Vector、pGL4.70[hRluc] Vectorの相違点をまとめた表5をご参照ください。

表5. 各ウミシイタケルシフェラーゼ発現ベクターの比較

  pRL phRL pGL4.70[hRluc]
ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の名称 Rluc(native) hRluc hRluc
哺乳動物での発現に最適化したコドンへの改変 ×
予測される転写調節因子結合部位の除去 なし ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子のみ ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子 + ベクターバックボーン
安定発現株作成用ベクター なし なし pGL4.76
[hRluc/Hygro]

図5. hRluc(pGL4とphRL)とRluc(pRL)の転写因子結合部位

図6. hRluc(pGL4とphRL)とRluc(pRL)の発現効率の比較

 

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Q. ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子をコードするpGL4 .7シリーズのベクターはどのように使い分けるのですか?

表6に示した特長と用途をベクター選択の参考にしてください。

表6. ウミシイタケベクターpGL4.7シリーズの特長と用途

製品名
(カタログ番号)
pGL4.70
[hRluc]
(E6881)
pGL4.71
[hRlucP]
(E6891)
pGL4.72
[hRlucCP]
(E6901)
pGL4.73
[hRluc/SV40]
(E6911)
pGL4.74
[hRluc/TK]
(E6921)
pGL4.75
[hRluc/CMV]
(E6931)
プロモーター なし なし なし SV40 TK CMV
分解促進配列 なし PEST CL1 & PEST なし なし なし
安定株
作成用ベクター
(カタログ番号)
pGL4.76
[hRluc/Hygro]
(E6941)
pGL4.77
[hRlucP/Hygro]
(E6951)
pGL4.78
[hRlucCP/Hygro]
(E6961)
なし なし なし
用途 一般的なレポーターアッセイ 短時間に最大の発現誘導率を得る必要のあるアッセイ※1 陽性コントロール ホタルルシフェラーゼベクターに対する内部標準※2 陽性コントロール

※1 : pGL4.72[hRlucP] Vectorはタンパク質分解配列であるCL1とPESTを含むため、pGL4.71[hRlucCP] Vectorよりも低い発光量を示します。
※2 : 一般的には、内部標準用のベクターとしては、pGL4.74[hRluc/TK] Vectorをお薦めいたします。トランスフェクション効率などの条件を検討しても発現量が低い場合に、TK promoterよりも強力なプロモーターを含むpGL4.73[hRluc/SV40] VectorやpGL4.75[hRluc/CMV] Vectorをご利用ください。

 

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Q. ホタルルシフェラーゼ発現に対する内部標準に使用するにはどのベクターが良いのでしょうか?

pGL4.74[hRluc/TK] Vectorをお薦めします。pGL4.74[hRluc/TK] Vectorでは、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子およびベクターバックボーンの双方から、内在する転写調節因子結合部位の除去を行っているため、非特異的な発現が最低限に抑制されます。そのため、刺激により、ホタルルシフェラーゼの発現だけでなく、ウミシイタケルシフェラーゼの発現まで上がってしまう”共上がり” 現象を最小限に抑えることができ、適当な内部標準値を得ることができます。

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Q. ルシフェラーゼ遺伝子の下流にタンパク質分解配列のCL1やPESTを含むレポーターベクター(pGL4.11[luc2P]、pGL4.12[luc2CP]、pGL4.71[hRlucP]、pGL4.72[hRlucCP])は、通常のレポーターベクター(pGL4.10[luc2]やpGL4.70[hRluc])に対して、どのような特徴を示しますか。

タンパク質分解配列であるCL1やPESTの存在により、ルシフェラーゼタンパク質の細胞内における安定性が低下します。このために、発現したルシフェラーゼタンパク質が、細胞内に蓄積する量が少なくなるため、刺激により発現したルシフェラーゼの微小な変化をより早いタイミングで観察することができます。
この特徴により以下のような利点が挙げられます。

・ 転写反応に対する迅速な応答の実現(GPCRの受容体解析など)
・ インキュベーション時間が短縮されるため、2次的影響によるリスクの低減

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Q. どのような原理で応答性が上がるのですか?

ルシフェラーゼアッセイにおける発光量は、ルシフェラーゼタンパク質の細胞内での蓄積量(酵素の半減期に依存)と新しく発現したルシフェラーゼタンパク質の総量を反映しています。Rapid ResponseタイプのpGL4 Vectorでは、ルシフェラーゼ遺伝子の下流にタンパク質分解配列(hCL1とhPEST)を付加することで、発現したルシフェラーゼタンパク質の半減期が短くなり、ルシフェラーゼタンパク質の細胞内での蓄積量を減少させます。つまり、バックグラウンドとなるルシフェラーゼタンパク質の蓄積量が小さくなるため、新たに発現したルシフェラーゼタンパク質による微小なシグナル変化を測定できるようになります。

注: Rapid Response型のレポーターベクターでは、刺激後に発現したルシフェラーゼタンパク質はタンパク質分解配列の影響により、インキュベーション時間に応じて減少することがあります。

 

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Q. 他のレポーターに比べて、Rapid Response Reporter Vectorsの発現量と半減期はどのようになっていますか?

比較表を以下に示します。

  ホタル ルシフェラーゼ ウミシイタケ ルシフェラーゼ
ベクター pGL4.10
[luc2]
pGL4.11
[luc2P]
pGL4.12
[luc2CP]
pGL4.70
[hRluc]
pGL4.71
[hRlucP]
pGL4.72
[hRlucCP]
誘導倍率が最大に
達するために
必要な時間※1 (hour)
4.5 4.5 3.0 6.0 4.0 2.0
刺激から2時間後の
誘導倍率
6.6倍 13.8倍 21.6倍 2.7倍 6.3倍 12.2倍
相対的な発光シグナルの
強度※2
100% 18.7% 3.9% 100% 40% 5.8%

※1 : ホタルルシフェラーゼは図1参照、ウミシイタケルシフェラーゼは図2参照
※2 : 図3参照

図1. ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むpGL4.1 Vectorシリーズにおける誘導倍率

CRE (cAMP response element)とHSV-TKプロモーターを挿入したpGL4 VectorをHEK 293 cellsにトランスフェクションし、24時間後に100μM RO (RO-20-1724)と1μM ISO (isoproterenol hydrochloride)を添加し、ルシフェラーゼの発現を誘導した。また、100μM ROのみを添加したものを非誘導のコントロールとした。誘導後1時間ごとに細胞を回収し、溶解したライセートをLuciferase Assay System (カタログ番号 E1500)でアッセイした。縦軸の値は、’誘導処理したサンプルの発光量’に対する’未処理のサンプルで得られた発光量’の”誘導倍率”を表す(図4参照)。

図2. ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を含むpGL4.7 Vectorシリーズにおける誘導倍率

CRE (cAMP response element)とHSV-TKプロモーターを挿入したpGL4 VectorをHEK 293 cellsにトランスフェクションし、24時間後に100μM RO (RO-20-1724)と1μM ISO (isoproterenol hydrochloride)を添加し、ルシフェラーゼの発現を誘導した。また、100μM ROのみを添加したものを非誘導のコントロールとした。誘導後1時間ごとに細胞を回収し、溶解したライセートをRenilla Luciferase Assay System (カタログ番号 E2810)でアッセイした。縦軸の値は、’誘導処理したサンプルの発光量’に対する’未処理のサンプルで得られた発光量’の”誘導倍率”を表す。縦軸の”誘導倍率”は、’誘導処理したサンプルの発光量’に対する’未処理のサンプルで得られた発光量’の値を表す(図4参照)。

図3. pGL4.1 VectorsおよびpGL4.7 Vectorsの間における発現量の比較

CRE (cAMP response element)とHSV-TKプロモーターを挿入したpGL4 Reporter Vector (ホタルルシフェラーゼ : pGL4.10[ luc2], pGL4.11[ luc2P], pGL4.12[ luc2CP] および ウミシイタケルシフェラーゼ : pGL4.70[ hRluc], pGL4.71[ hRlucP], pGL4.72[ hRlucCP])を内部標準用ベクターと共にHEK 293 cellsにトランスフェクションした。トラスフェクションから24時間後に細胞を回収し、Passive Lysis Bufferで溶解し、Dual-Luciferase® Reporter Assay Systemで発光量を測定した。内部標準値で補正した値を縦軸にプロットした。

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minP

Q. minPとは、何ですか?

minPとは、遺伝子の転写開始に必要なTATA boxを含む最小プロモーター(minimal promoter)のことです(図1)。

pGL4ベクターのマルチクローニングサイトとminP配列

図1.pGL4ベクターのマルチクローニングサイトとminP配列

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Q. minPが導入されたベクターはどのようなアッセイに利用されますか?

レポーターアッセイでは、遺伝子の5’上流に存在するプロモーターの転写活性を測定するだけでなく、そのプロモーター領域に含まれる転写因子の応答配列特有な転写活性を測定することもあります。このようなレポーターアッセイでは、転写因子の応答配列のみを従来のpGL4 ベクター(pGL4.10)に導入しても、最小プロモーターが存在しないため、正確に転写因子特有な転写活性を測定することはできません。
このようなことから、プロメガでは、あらかじめ最小プロモーターであるminPを導入したpGL4ベクターをご用意しました。

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Q. minPの由来は、何です?

人工的に合成した配列であるため、由来となる生物等の情報はありません。

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Q. minP導入済みベクターpGL4ベクターは、どのような製品がありますか?

表1にベクターの特長と用途を示します。ベクター選択の参考にしてください。

表1. minP導入済みpGL4 ベクターシリーズの特長と用途

製品名
(カタログ番号)
pGL4.23
[luc2/minP]
(E8411)
pGL4.24
[luc2P/minP]
(E8421)
pGL4.25
[luc2CP/minP]
(E8431)
pGL4.26
[luc2/minP/
Hygro]
(E8441)
pGL4.27
[luc2P/minP/
Hygro]
(E8451)
pGL4.28
[luc2CP/minP/
Hygro]
(E8561)
プロモーター/
応答配列
minP minP minP minP minP minP
タンパク質
分解配列
なし hPEST hCL1 + hPEST なし hPEST hCL1 + hPEST
薬剤選択
マーカー
なし なし なし あり
(Hygromycin)
あり
(Hygromycin)
あり
(Hygromycin)
用途 一般的な
レポーターアッセイ
短時間に最大の誘導倍率を得る必要がある
レポーターアッセイ*
安定発現株の作成

* luc2CPは、タンパク質分解配列であるCL1とPESTを含むため、luc2よりも低い発光値を示します。

表2. 転写因子応答配列およびminP導入済みpGL4ベクターシリーズの特長と用途

製品名
(カタログ番号)
pGL4.29
[luc2P/CRE/Hygro]
(E8471)
pGL4.30
[luc2P/NFAT-RE/Hygro]
(E8481)
pGL4.32
[luc2P/NF-kB-RE/Hygro]
(E8491)
応答配列
配列
(繰り返し回数)
CRE
5'-TGACGTCA-3'
( 3回 )
NFAT-RE
5'-GAAAA-3'
( 3回 )
NF-kB-RE
5'-GG A( A/C) TTTCC-3'
( 5回 )
タンパク質
分解配列
hPEST hPEST hPEST
薬剤選択
マーカー
あり
(Hygromycin)
あり
(Hygromycin)
あり
(Hygromycin)
用途 GPCRを介したシグナル経路の研究 ストレス、アポトーシス
シグナル経路の研究

すべてのベクターは、動物細胞用薬剤選択マーカーが含まれているため安定発現株作成にも利用することができます。

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Q. 現在販売されているpGL4ベクター(転写因子応答配列+ minP)以外に今後販売する予定はあ りますか?

他の応答配列とminPを導入したベクターの販売は、検討中です。

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Q. minPを用いる利点は何ですか?

レポーターアッセイでは、バックグラウンドでの発現量が低く、薬剤等の刺激により速やかに応答すること(ダイナミックレンジが広い)が重要です。
従来、HSV-TKプロモーターが応答配列の研究に利用されてきましたが、バックグラウンドが高く、ダイナミックレンジが狭いことが問題でした。 新たにプロメガでご用意したminPを持つpGL4ベクターでは、この点が改良されており、TKプロモーターと比べて、バックグラウンが低く、薬剤等の刺激により、速やかにかつ高い誘導倍率でシグナルが得られます(図2)。

CRE-minPを含むpGL4の誘導倍率

図2.CRE-minPを含むpGL4の誘導倍率

luc2Pレポーター遺伝子上流にCREおよびHSV-TKプロモーターの一部を含むpGL4.11 (pGL4.11-CRE-TK)、CREを含むpGL4.24 (pGL4.24-CRE)をそれぞれ内部標準用ベクター(pGL4.74)とともにHEK293細胞にトランスフェクションした。24時間後、1uMイソプロテレノールを添加して内在する受容体を刺激し、4時間後のレポーター活性を測定した。

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GloResponse™ Luciferase Reporter Cell Lines

Q. GloResponse™ Luciferase Reporter Cell Linesとは何ですか?

GloResponse™ Luciferase Reporter Cell Linesは、標的のパスウェイ解析を行うレポーターアッセイに最適化されたルシフェラーゼレポーターベクターが組み込まれた細胞株です。目的のパスウェイに対する特異的な応答エレメントとminimal promoterを有するpGL4ベースのベクターをHEK293細胞に安定に導入してあります。各ベクターには選択マーカーとしてhygromycin耐性遺伝子が挿入されています。
また、レポーターとして不安定化ルシフェラーゼ(luc2P)を使用しているため、転写ダイナミクスに対する鋭敏な応答が得られます。

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Q. GloResponse™ にはどのような製品がありますか?

現在ご用意している製品は、以下の3つです。

表1. GloResponse™ Luciferase Reporter Cell Lines

製品名 応答配列 カタログ番号 サイズ

GloResponse™ CRE-luc2P HEK293 Cell Line

3X CRE

E8500

2本※

GloResponse™ NFAT-RE-luc2P HEK293 Cell Line

3X NFAT-RE

E8510

2本※

GloResponse™ NF-κB-RE-luc2P HEK293 Cell Line

5X NF-κB-RE

E8520

2本※

※1本はバックアップ用です。

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Q. 安定発現株を自作するのと比較して、GloResponse™ を使うことの利点は何ですか?

安定発現株を自作する場合、トランスフェクション、クローニング、各クローンの発現確認などを行う必要がありますが、これらの実験にかける時間および試薬などのコストを省くことができます。
また、苦労してとったクローンの性質が継代を重ねるうちに変わってしまい、安定して実験を行うことができないケースもあります。プロメガでは、各GloResponse™ 細胞株を30回以上継代した場合でも刺激に対する応答性が変わらないことを確認しています。

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Q. GloResponse™ の培養条件を教えてください。

製品が届いたら、2本のバイアルのうち1本はバックアップとして凍結保存し、もう1本はできるだけ早く解凍して増殖するか確認してください。増殖しないなどの問題がある場合はバックアップを解凍し、2本ともうまく増殖しない場合は、テクニカルサービスまでお知らせください。出荷したバイアルは長期保存用ではないため、バックアップ用チューブも届いてから30日以内に解凍し、長期保存用に凍結しなおすことをお勧めします。
通常の培養には10% FBS, 50μg/ml hygromycin Bを含有するDMEMを使用してください。アッセイの直前や凍結保存する前は、hygromycin Bを含まない培地を使用します。
細胞を凍結する際には、凍結用の培地(80% DMEM, 15% FBS, 5% DMSO)を使用してください。

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Q. コントロールになる薬剤はありますか?

各細胞株でのコントロールは、以下の薬剤が使用できます。

表2. GloResponse™ ポジティブコントロール

製品名 ポジティブコントロール
(終濃度)
ストック溶液
GloResponse™ CRE-luc2P HEK293
Cell Line
100μM forskolin Forskolin, 100mM in DMSO
GloResponse™ NFAT-RE-luc2P
HEK293 Cell Line
50ng/ml PMA
+ 5μM ionomycin
PMA, 1mg/ml in DMSO
Ionomycin, 0.75mg/ml in DMSO
GloResponse™ NF-κB-RE-luc2P
HEK293 Cell Line
20ng/ml TNFα TNFα(500X), 10μg/ml in 1X PBS
with 1mg/ml BSA

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Q. GloResponse™ を注文する際の注意点を教えてください。

GloResponse™ Luciferase Reporter Cell Linesは、他のプロメガ製品とは異なり、お客様へ直送します。受け取り日程については、テクニカルサービスにご相談ください。
製品が届いた後は速やかに増殖を開始してください。出荷時のバイアルは長期保存用ではないため、できるだけ早く解凍することをお勧めします。培養条件はこちらをご参照ください。

 

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 その他のルシフェラーゼレポーターベクター

pGL2, pGL3 一般

Q. pGL3 Basic VectorのマルチクローニングサイトのXho I が消化されにくい場合があるのはなぜですか?また、その対処法は何ですか?

Xho I 認識部位付近が高次構造を形成しやすい配列になっており、制限酵素がうまく反応できないことが考えられます。一度、別の酵素で消化し、スーパーコイル構造を解いてから、Xho Iで消化することをお勧めします。

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Q. プロメガのLuciferase Reporter Vector - pGL3はpGL2 とどこが違うのですか。

pGL3 Vector はpGL2 Vectorを改良して作製されました。主な改良点は以下の通りです。

ルシフェラーゼ遺伝子(lucからluc+へ)の修飾

  1. ペルオキシゾーム標的シークエンスの除去
  2. AP1、AP2、SP1、TGT-3、およびLF-A1遺伝子調節因子結合のためのコンセンサス・シークエンスの除去
  3. 哺乳類および植物用に改良されたコドンを使用
  4. 可能な糖鎖付加サイトの除去

ベクターの修飾

  1. 転写終結とルシフェラーゼ転写産物のポリアデニル化効率が増加するように、SV40 early poly(A)シグナルがSV40 late poly(A)シグナルに変わりました。
  2. ベクターの途中から開始する擬似の転写が終結するように、poly(A) および転写停止サイトをマルチクローニングサイトの上流に配置しました。
  3. 予期せぬRNAスプライシングによるリポーター遺伝子発現の減少を避けるために、small T intron が除去されました。
  4. ルシフェラーゼ遺伝子の翻訳効率を上げるためにKozak Consensus Sequenceを挿入しました。
  5. luc+とのN末端融合タンパク質の構築のためにluc+遺伝子の5'末端側にNco Iサイトを加えました。
  6. サブクローニング用に、luc+遺伝子のすぐ下流に単一のXba Iサイトを作成しました。
  7. 平滑末端のインサートが制限酵素によって両側で切れるようにSma Iサイトがマルチクローニングサイトの内部に移されました。

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Q. pGL2とpGL3ではルシフェラーゼの発現量にどの程度の差がありますか?

細胞の種類によって、異なります。pGL2-Control vector とpGL3-Control vectorを比較した場合、HeLa 細胞では、50-70倍、NIH3T3 細胞では、100-700倍、CHO細胞では20倍、pGL3-Control vectorの方が発現量は高くなります
(図: pGL2とpGL3の比較)

*プロメガでは、さらに新しいレポーターベクターとして、pGL4 Luciferase Reporter Vectorsをご用意しております。pGL4はpGL3 よりもさらに変則的発現を低減し、極めて高いシグナルーバックグラウンド比をもちます。

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Q. pGL2またはpGL3-Control, -Basic, -Promoter, -Enhancer Vectorのルシフェラーゼの発現量は、どの程度違いますか?

細胞の種類によって異なります。
HeLa 細胞、NIH3T3 細胞、CHO細胞での事例を示しましたので参考にしてください。

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 シングル ルシフェラーゼ定量システム

Bright-Glo™, Steady-Glo®, Luciferase Assay System, Renilla Luciferase Assay system

プロメガではシングルルシフェラーゼアッセイ定量システムとして、3種類のホタルルシフェラーゼ測定システムと1種類のウミシイタケルシフェラーゼ測定システムをご用意しております。各システムの特長を別表にまとめてあります。

ホタルルシフェラーゼの発光半減期は、Steady-Glo® >Bright-Glo™>Luciferase Assay Systemの順で長くなっていますが、発光値は、Steady-Glo® <Bright-Glo™<Luciferase Assay Systemの順で低くなります。サンプル数や使用するルミノメーターの種類、研究の目的に合わせて使い分けてください。

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 デュアル ルシフェラーゼ定量システム

Dual-Glo™ Luciferase Assay System, Dual-Luciferase® Reporter Assay System

Q.ウミシイタケルシフェラーゼの活性は、ホタルルシフェラーゼの活性とどのような違いがありますか? また、2つのレポーターベクターの共トランスフェクションにはどのような条件が推奨されますか。

ホタルルシフェラーゼはATP、マグネシウム、および酸素の存在下でルシフェリンに作用します。ウミシイタケRenilla reniformisから得られたウミシイタケルシフェラーゼは、酸素の存在下でセレンテラジンに作用します。これらの発光は似ていますが、ホタルルシフェラーゼは分子量61kDa、ウミシイタケルシフェラーゼは分子量が36kDaです。そのため、同量の2つの酵素をアッセイするときには分子数で69%多いウミシイタケルシフェラーゼを測定していることになります。1モルあたりでは、ホタルルシフェラーゼのほうがウミシイタケルシフェラーゼよりもおよそ53%大きい発光強度を持つことが、Dual-Luciferase® Reporter Assay Systemを用いて経験的にわかっています。詳しくは参考資料(1)をご覧ください。

共トランスフェクションされたプラスミド上のプロモーター間に起こるトランス効果はレポーター遺伝子の発現に強く影響します(2)。これは、コントロールまたは実験用レポーターベクターが非常に強いプロモーター/エンハンサーエレメントを含むときに、特に注意しなければなりません。phRL VectorのTK、SV40、およびCMVプロモーターは、ほとんどの哺乳類細胞で違うレベルで発現されます。phRL‐TKのHSVチミジンキナーゼプロモーターは比較的弱く、ウミシイタケルシフェラーゼコントロールベクターを継続的に中程度発現させたいときにもっとも役に立ちます。SV40 earlyおよびCMV immediate earlyプロモーター/エンハンサー領域は、高レベルの転写活性があり、強い調節因子を持つ実験ベクターを含む重レポーターの実験には向かないかもしれません。さらに、SV40プロモーターとCMVプロモーターには、SP1、AP1およびAP2の転写因子認識シークエンスが含まれます。このような転写因子の実験プロモーターに対する影響を調べているのであれば、SV40およびCMVコントロールレポーターの使用は推奨できません。

実験用とコントロールのレポーター遺伝子間で独立した遺伝子発現を確実にするため、プロモーターエレメント間のトランス効果を減少させる(または抑制する)必要があります。また共トランスフェクションされたベクターの発現レベルをコントロールするために、実験用のベクターのウミシイタケルシフェラーゼベクターに対するトランスフェクション比率は10:1、50:1、200:1またはそれ以上が推奨されます。詳しくはDual-Luciferase® Reporter Assay System Technical Manual #TM040をご覧ください。

参考文献:

1.Sherf,B.A. et al. (1996) Promega Notes 57,2

2.Farr,A. and Roman,A. (1991) Nucl. Acids Res. 20,920

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Q.レポータートランスフェクションの結果を標準化することは、なぜ必要なのですか?
また、どのような内部標準ベクターを使うのが最も良いですか?

真核細胞における一過的なレポータータンパク質の発現は、遺伝子発現の様々な側面を分析する強力なツールです。多くの場合、遺伝子発現の制御に関わる調節因子は、レポーターベクターにクローニングされ、調節因子が遺伝子発現に及ぼす影響を調べるためにこれらのキメラベクターが細胞にトランスフェクトされます。一般的なレポーター遺伝子には、ホタルルシフェラーゼや、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ(CAT)、グリーン・フルオレセント・プロテイン(GFP)、βーガラクトシダーゼが含まれます。トランスフェクトされた細胞にさまざまな処理を与えることで、これらの処理がレポーター遺伝子の発現に及ぼす影響を測定できます。

ほかの要因も一時的な発現の研究から得られる結果に影響を与えます。これらの要因には、レポーター・アッセイ試薬の多様性と共に、(1)培養細胞の数や健康度の違い、(2)細胞のトランスフェクション効率や(3)細胞溶解の効率の違いが含まれます。これらの要因を補うために、2番目のレポーターベクターがトランスフェクション実験に取り入れられます。これにより、実験のためのレポーター遺伝子の発現がコントロール・レポーター遺伝子の発現で標準化されます。標準化のためのベクターは、実験のためのレポーターベクターに対して行われる処理に反応しないプロモーターの転写調節下に、レポーター遺伝子を含みます。実験のためのレポーターの活性をコントロール・レポーターの活性で標準化することで、レポーターアッセイで問題とされるアッセイ毎のばらつきを取り除きます。
以下の表は、Dual-Luciferase® Reporter Assay Systemを使っている典型的なトランスフェクション実験で得られるデータの抽出標本を示しています。


表 Dual-LuciferaseR Assay Systemを用いたトランスフェクション実験における活性定量

Day1
Treatment
Replicate
Luciferase Activity (RLU) Ratio
(F:R)
Normalized Fold
Change in Activity
Firefly (F) Renilla (R)
Control        
1 5,128 2,511    
2 7,553 3,815    
3 10,555 5,413    
  7,745 3,913 1.98 1.00
Treatment A        
1 51,376 4,467    
2 40,712 3,574    
3 88,787 7,654    
  60,292 5,232 11.52 5.82
Treatment B        
1 587,635
5,144    
2 988,347 8,832    
3 409,881 3,564    
  661,954 5,847 113.21 57.18
Control treatment = no treatment; RLU = relative light units, Except for the final column, values in boldface type are averages.
 
Day2
Treatment
Replicate
Luciferase Activity (RLU) Ratio
(F:R)
Normalized Fold
Change in Activity
Firefly (F) Renilla (R)
Control        
1 15,529 20,433    
2 21,897 30,841    
3 10,760 13,620    
  16,062 21,631 0.74 1.00
Treatment C        
1 850,239 20,843    
2 578,951 14,830    
3 943,873 21,788    
  791,021 19,154 41.30 55.81
Treatment D        
1 14,865 19,305    
2 8,967 12,284    
3 13,767 20,246    
  12,533 17,278 0.73 0.99
Control treatment = no treatment; RLU = relative light units, Except for the final column, values in boldface type are averages.


トリプリケートで同じ種類の細胞に、同じホタルルシフェラーゼ遺伝子を含む、実験のためのレポーターベクターと、内部標準としてTK(tymidine kinase)プロモーターの支配下にあるウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を含むコントロール・レポーター・ベクターを共トランスフェクションしました。ルシフェラーゼのレポーター活性は、同じ組の中でかなり大きく変わります(例えばDay2コントロールのホタルルシフェラーゼの活性は10,000~21,000RLUの範囲にあります)。しかし、ホタルとウミシイタケルシフェラーゼの活性の比率を求めると、様々なレプリケートの値が標準化され、お互いに近似の比率となります(例えば、0.76、0.71、0.79)。

下記の等式は、活性の標準化した倍率の変化を決めるために使われます。

(F/R)sample
ΔFold Activity = ――――――――
(F/R)control
 
Fはホタルルシフェラーゼの活性で、Rはウミシイタケルシフェラーゼの活性

例えば、Day2の処理Cは、次のようになります。

(791,021/19,154)
ΔFold Activity = ―――――――――――
(16,062/21,631)
(41.30)
= ―――――
(0.74)
= 55.81

ホタルルシフェラーゼとウミシイタケルシフェラーゼの活性の比率が実験間で異なるため、トランスフェクション実験間のデータを比較するには、共通のサンプル(コントロールトランスフェクションの繰り返し)が含まれるようにします。

この例が表に示されています。例えば、Day1のコントロール処理のホタルルシフェラーゼとウミシイタケルシフェラーゼの活性の比率は、1.98です。一方、Day2の比率は0.74です。2日間に共通のサンプルを行わず、結果を標準化するために、最初の日のトランスフェクション実験のコントロールの結果に頼らなければならないとすると、処理Cの活性は処理Bで得られた活性のわずか37%になります。しかし、コントロール処理が両方の日に行われ、活性がその日のコントロールの結果で標準化されると、処理Bと処理Cは、同じ活性の増加になります。このように、正確な比較をするためには、異なるトランスフェクション実験間で変化しない処理を含めることが必要になります。「共通」のトランスフェクションで使用される2つのプラスミドの相互の活性は、実験間で変化しないと仮定されています。

適切な内部標準ベクターの選択は、レポーターベクターの項目のpRL, phRL, phRG をご参照ください。

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Q. Dual-Liciferase® Reporter Assay SystemとDual-Glo™ Luciferase Assay Systemの違いは何ですか?

Dual-Luciferase® Reporter Assay System (以下、DLR) とDual-Glo™ Luciferase Assay System (以下Dual-Glo™)は、共にホタルルシフェラーゼとウミシイタケルシフェラーゼを連続的に測定するデュアル‐ルシフェラーゼ定量システムです。Dual-Glo™は、ホモジニアスアッセイ(ワンステップ型) 試薬で、長時間発光タイプ(発光半減期がホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼともに2 時間)です。そのため、検体数が多く、測定に時間がかかる場合でも安定した結果が得られます。しかし、発光量はDLRよりも低くなります。サンプル数が少ない場合、あるいは高い発光量を必要とする場合は、DLR(発光半減期:ホタルルシフェラーゼ 15分、ウミシイタケルシフェラーゼ 2分)をお勧めします。

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Dual-Liciferase® Reporter Assay System (E1910, E1960, E1980)

Q. ホタルルシフェラーゼとウミシイタケルシフェラーゼの発光半減期はどの程度ですか?

発光半減期は、ホタルルシフェラーゼが15分、ウミシイタケルシフェラーゼが2分です。

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Q. 未開封での保存期間はどのくらいですか? また、調製後の試薬、Luciferase Assay Reagent II (Luciferase Assay Substrate+Luciferase Assay Buffer II)とStop & Glo® Reagent (Stop & Glo® Substrate+Stop & Glo® Buffer) の保存期間はどのくらいですか?

未開封の場合は、-20℃保存で6ヶ月が保証期間です。未開封の場合、2年程度は試薬の安定性に問題ありません。調製後の試薬、Luciferase Assay Reagent IIの保存期間は、-20℃で1ヶ月、-70℃で1年です。室温では8時間安定です。Stop & Glo® Reagentは、使用直前にサンプル数にあわせて調製することをお勧めします。ちなみに22℃に置いた場合、48時間で8%活性が減少します。-20℃では、15日間の保存が可能です。

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Q. Luciferase Assay Buffer IIとStop & GloR® Bufferを室温で溶解させた時、析出物が見られますが、問題ありませんか?

析出物がある状態での使用は避けてください。
析出物が見られる場合は、37℃で15分程度加温してからお使いください。

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Q. Luciferase Assay Reagent IIのかわりに、ホタルルシフェラーゼ定量システムLuciferase Assay System (カタログ番号:E1500) のLuciferase Assay Reagentを使ってDual-Luciferase® Assayはできますか?

Luciferase Assay Reagent IIと Luciferase Assay Reagentでは、組成が異なりますので、代替はできません。
DLRでホタルルシフェラーゼを測定する場合は、システムに含まれるLuciferase Assay Reagent IIをご使用ください。

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Q. ホタルルシフェラーゼとウミシイタケルシフェラーゼの発光値にばらつきが見られます。原因と して何が考えられますか?

次の項目について再確認してください。

〈細胞、試薬〉

  1. トランスフェクションに使用するプラスミドの純度は?(A260/A280 1.8-1.9程度ですか?)
  2. 細胞のPBS(-)洗浄操作を十分に行ってください。(培地成分のMg2+やCa2+は、ルシフェラーゼ反応に影響を与えます。)
  3. 細胞の溶解は十分ですか?(溶解し難い場合は、凍結融解を行ってください。)
  4. 試薬の調製は正しく行っていますか?(Stop & Glo® Reagentの調製は、基質がチューブ内壁に吸着する恐れがありますので、ガラスあるいはシリコンコートしたチューブで行ってください)
  5. 使用前に試薬は均一になっていますか?(凍結保存した試薬は、濃度勾配が生じていますので、十分な混合が必要です。)
  6. アッセイに使用する試薬、細胞ライセートは、ルシフェラーゼ反応に適した室温になっていますか?
  7. pGL3 Control Vector(カタログ番号:E1741)を用いて、お使いになる細胞や測定機器で、測定可能範囲内の発光量が得られる条件をご検討ください。

〈機器〉

  1. QuantiLum® Recombinant Luciferase(カタログ番号:E1701)を用いて、お使いのルミノメーターの測定可能範囲(リニアレンジ)を決定してください。サンプルの発光値は、リニアレンジ内であることを確認してください。
  2. 蛍光/発光マルチタイプの測定機器の場合は、正しい設定であることを確認してください。

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Q. ルシフェラーゼ活性は、刺激後どのくらいの時期から測定できますか?

刺激後、6時間程度で発光量最大になるデータがあります。しかし、細胞の種類や培養条件で異なりますので、経時的に測定し、差が明らかに見えるポイントでアッセイしてください。

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Q. シングルチューブタイプのルミノメーターを使用しています。ホタルルシフェラーゼ活性を測定して、その後ウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定することは可能ですか?

測定は可能です。Luciferase Assay Reagentは、室温で8時間安定です。Stop & Glo Reagentは、22℃、48時間で8%活性減少します。

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Dual-Glo™ Luciferase Assay System (E2920, E2940, E2980)

Q. 保存期間はどのくらいですか?

未開封のDual-Glo® Stop & Glo Substrate とDual-Glo® Luciferase Substrateは-20℃、Dual-Glo® Stop & Glo Bufferと Dual-Glo® Luciferase Bufferは室温で保存し、消費期限内にお使いください。
Dual-Glo® Luciferase Assay Reagent(Dual-Glo™ Luciferase Substrate+Dual-Glo™ Luciferase Buffer)は調製後、
室温8時間、4℃48時間、-20℃1週間、-70℃6ヶ月間の保存で活性が10%低下します。また、5回の凍結融解で活性が15%低下します。Dual-Glo® Stop & Glo® Reagent(Dual-Glo™ Stop & Glo® Substrate+Dual Glo™ Stop & Glo® Buffer)は使用直前の調製をお勧めします。調製後室温8時間で8.1%、4℃24時間で8.5%の活性が低下します。

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Q. Dual-Glo™ Luciferase BufferとDual-Glo™ Stop &Glo® Bufferに析出が見られますが、問題ありませんか?

析出物がある状態での使用は避けてください。析出物が見られる場合は、37℃で2時間を限度として撹拌しながら加温し、析出物を溶解させてからお使いください。

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Q. 96ウェルプレート以外で細胞を培養した場合、どのように測定すればよいですか?

培地と等量のDual-Glo™ Luciferase Reagentを添加して、測定します。但し、プレートのサイズによっては培地の量が多くなるため、大量の試薬が必要になることがあります。

Lysis Bufferで細胞ライセートを作製してアッセイすることは、推奨しておりません。どうしても必要な場合はテクニカルサービスにご相談ください。

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Q. 細胞を凍結保存して後日アッセイできますか?

以下の3つの方法で、細胞を凍結保存し後日アッセイすることができます。

  1. プレートから培地を取り除き、そのまま細胞を凍結保存します。アッセイする際にプレートを取り出し、75μlの培地を加えてください。後は通常のDual-Glo™ Luciferase Assay systemのプロトコールに従ってアッセイを行ってください。
  2. プレートから培地を取り除き、各ウェルにRLBを20μlずつ加えて凍結保存します。アッセイする際にプレートを取り出し、ライセートと同量のDual-Glo™ Luciferase Reagentを加えて測定します。後は通常のプロトコールに従ってアッセイを行ってください。この方法でサンプルを保存すると、シグナルが若干低下します。
  3. Dual-Glo™ Luciferase Reagent を細胞に加えた後、-80℃で保存することもできます。アッセイ時は室温でサンプルを融解し、混和(プレートシェーカーの使用が望ましい)した後に測定します。この方法でサンプルを凍結保存すると一般的にシグナルが若干増大します。数週間の保存が可能です。

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Q. 添加した刺激物質を除いてから測定したいのですが、培地を捨てて、細胞に直接Dual-Glo™ Luciferase Reagentを加えることは可能ですか?

試薬濃度が、通常の測定時の2倍となるため、発光半減期が短くなる可能性があります。このような場合は、Dual-Glo™ Luciferase Reagent にあらかじめ等量のPBSを加えて2倍希釈した試薬を調製後、サンプルに加えてください。

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Q. Dual-Glo™ Luciferase Assay Systemの推奨する発光測定時間はどのくらいですか?

一般的に、1ウェルあたり1秒で測定します。多くのルミノメーターでは発光量はcps (count per second)というように、1秒あたりにカウントした光電子の数としてあらわします。つまり5秒の測定時間を取った場合、その間に得られたカウントの1/5を表示値とします。プロメガの発光試薬は安定した発光量を示すため、1秒の測定で十分です。

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 デュアル カラー・ルシフェラーゼ定量システム

Chroma-Glo™ Luciferase Assay System

Q. Chroma-Glo™ Luciferase Assay Systemとは、どのようなシステムですか?

Chroma-Glo™ Luciferase Assay Systemは、赤色もしくは緑色の発光を有する2種類のChroma-Luc™ Vectorをトランスフェクションした細胞から、1種類の基質を加えるだけで、それら2色の発光を区別して簡便に測定することができます。2色発光は、分光フィルターで測定するため、個々のルシフェラーゼを区別し、事実上同時に検出することができるシステムです。また、発光は長時間安定なので、マルチウエルプレートを利用したハイスループットの実験系にも適しています。

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Q. Chroma-Glo™ Reporter VectorとChroma-Glo™ Reagent (基質 + 溶解バッファー)で産生される発光の波長を教えてください

pCBRluc Vector由来の赤色発光の極大波長は613nmです。また、pCBG68lucおよびpCBG99luc Vectorに由来する緑色発光の極大波長は537nmです。

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Q. Chroma-Glo™ Reagentにより産生される赤色と緑色の発光シグナルはどのように検出するのでしょうか?

このキットの発光は、分光フィルターを取り付けることができる発光検出器(光電子増倍管を利用したルミノメーターまたはCCDカメラ)で検出します。プロメガでは、赤色の発光用として610nm long passフィルターを、緑色の発光用として510±30nmのフィルターを推奨いたします。
これらのフィルターで得られた赤色と緑色の発光値を、Chroma-Luc™ Calculatorに入力することにより、補正された赤色と緑色の発光値を得ることができます。元となる計算式はChroma-Glo™ Luciferase Assay Systemのマニュアル(http://www.promega.com/tbs/tm062/tm062.pdf)に記載されています。Chroma-Luc™ Calculatorの具体的な使用方法についてはこちらをご覧ください。

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Q. Chroma-Glo™ アッセイ用にフィルターはどこから入手できるでしょうか?

プロメガ取り扱い製品(ターナー社製 ルミノメーター)または、フィルター専門メーカーについてはプロメガまでお問い合わせください。その他の機器に関しましては、ご使用されている機器のメーカーにご確認ください。

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Q. Chroma-Glo™ Luciferase Assay の測定が可能な機器かどうかは何を確認すればよいですか?

一般的にフィルターを装着できるタイプのルミノメーターやフルオロメーターならばChroma-Glo™ Luciferase Assayの測定が可能です。お使いのルミノメーターやフルオロメーターで測定可能かどうか、フィルターの取り付けや付け替えについて不明な場合には、プロメガもしくは機器メーカーまでお問い合わせください。

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Q. Chroma-Glo™ Luciferase Assayにホタルルシフェラーゼアッセイ試薬を使用できますか?

Chroma-Luc™ルシフェラーゼはホタルルシフェラーゼとはキネティックスが異なっていますChroma-Luc™ Reporter Vectorに由来するルシフェラーゼが最適なパフォーマンスを示すために、Chroma-Glo™ Luciferase Assay Systemをお使いください。

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Q. Chroma-Glo™ Reagentの保存期間はどのくらいですか?

未開封の場合、-20℃で6ヶ月間保管できます。調製した試薬は、その当日に使ってください。
保存する場合には、-70℃で保存してください。-20℃で保存した場合、赤色発光は1週間ごとに20%以上の発光量の低下を示します。

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Q. 細胞ライセートを用いてChroma-Glo™ Luciferase Assayを行えますか?

行えます。細胞ライセートをChroma-Glo™ Luciferase Assayに使うためには、その溶解にGlo Lysis Buffer (カタログ番号:E2661)をご使用ください。

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 ルシフェラーゼ基質

EnduRen™ Live Cell Substrate

Q. EnduRen™ Live Cell Substrateは、レニラルシフェラーゼの一般的な基質であるセレンテラジンとどのように異なりますか?

EnduRen™は、ユニークな技術によりセレンテラジンの酸化を受けるサイトが修飾されています。そのため、セレンテラジンで問題になっていた基質の不安定性および自家発光(バックグラウンド)を最低限に抑えることが可能になりました。EnduRen™は標準的な培地に溶かすだけで、ほとんどの哺乳動物細胞種で基質が細胞内に透過します。そのため、細胞培養後にアッセイ試薬を新たに添加する操作が無いため、アッセイをより単純化できます。EnduRen™基質が細胞内に透過すると、細胞内のエステラーゼにより保護基が外れ、セレンテラジンhになります。これがウミシイタケルシフェラーゼの基質となり発光が開始します。

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Q.ホタルルシフェラーゼの基質ルシフェリンも生細胞アッセイに使用できますが、それと比較してEnduren™の利点は何ですか?

EnduRen™は、ルシフェリン比べ10~100倍の高い細胞膜透過性を示します。また、ルシフェリンに比べ細胞内で化学的に非常に安定です。

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Q. EnduRen™ Live Cell Substrateはどのようなアッセイに使えますか?

EnduRen™ Live Cell Substrateは、レポーターとしてのウミシイタケルシフェラーゼ活性を細胞溶解することなく経時的に定量できる基質です。

  1. ある刺激に対するルシフェラーゼ活性の経時的変化を同一細胞で測定できます。 (phRL Vectors使用時)
  2. 複数の刺激に対する応答性を同一細胞で測定できます。(Rapid Response Reporter Vectors: phRG(R2.1)-Basic Vector, phRG(R2.2)-Basic Vector使用時)
    また、EnduRen™ Live Cell Substrateは、以下のアッセイと組み合わせて使用することで、研究の幅が広がります。
  3. CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (G7570):
    経時的な測定後添加し細胞数の測定が可能です。
  4. Apo-ONE Homogeneous Caspase3/7 Assay (G7792)およびCaspase-Glo 3/7 Assay (G8090):
    レポーター遺伝子の発現とアポトーシスの関連を判定できます。
  5. psiCHECK-1 Vector(C8011):
    RNAiの効果を経時的に検出することが可能です。

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