TOPページ ＜ タンパク質翻訳・解析 ＜ 無細胞タンパク質発現系選択ガイド
無細胞タンパク質発現系選択ガイド
www.promega.co.jp/lit/tnttechno.html
無細胞タンパク質発現系には、RNAを鋳型にする方法とDNAを鋳型にする方法（転写/翻訳系）の2通りの方法があります。鋳型RNAとしては、Total RNA, mRNA, in vitro転写産物などを使用できます。鋳型DNAとしては、転写プロモーターと翻訳開始点の下流に組み込まれた目的遺伝子を含むプラスミドやPCR/RT-PCRの産物が使用できます。in vitro翻訳の最適なシステムの選択は、合成するタンパク質の遺伝子の由来（原核細胞/真核細胞）、鋳型の種類（DNA/RNA）、または合成後のタンパク質の使用目的などを考慮して行う必要があります。
発現システムの選択
一般的に真核細胞由来の配列を真核細胞システムで、あるいは原核細胞由来の配列を原核細胞のシステムで翻訳するような場合に問題が起こることは稀有です。翻訳タンパク質と機能的あるいは抗原的に交差性を示す成分が含まれることが考えられる時は、別の翻訳システムを選ぶことが必要です。翻訳後の修飾/プロセシングのためにミクロゾームメンブレンを使用することができるのはウサギレティキュロサイトだけです。小麦胚芽エキストラクトとミクロゾームメンブレンを組み合わせて使えるのは限定された反応条件に限られます。下の表に鋳型の種類に応じたタンパク質翻訳システムの選択ガイドがあります。
タンパク質翻訳システムの応用
TnT® システムはプラスミドに組み込まれた遺伝子からのタンパク質翻訳を、転写のステップを考慮する事なく容易かつ多量に行うことのできるシステムです。TnT® システムを使用した研究のBibliography (BL001) は200以上の参考文献が記載されています。その応用例にはProtein Truncation Tests (PTT), タンパク質/タンパク質相互作用, タンパク質/ DNA相互作用の研究、クローニング遺伝子の迅速な確認などがあります。BL001については弊社までお問い合せ下さい。
in vitro転写・翻訳とシステムの関係
プロメガ資料
www.promega.co.jp/lit/tnttechno.html
| Rabbit Reticulocyte Wheat | E. coli S30 | ||
|---|---|---|---|
| RNAの由来 | Lysate |
Germ Extract | Extract |
| 動物 | +++ | ++a | −b |
| 植物 | ++ | +++ | − |
| 細菌 | ++ | ++ | +++ |
| 動物ウイルス | +++ | −c | − |
| 植物ウイルス | +++ | +++ | − |
a 発現転写因子
b 翻訳後修飾は不可
c 脳心筋炎ウイルスの内部リボゾーム結合サイト(EMCV IRES)を持つ動物ウイルスは
Wheat Germ Extractでの発現は弱い
記号：(+++) 推奨; (++) 許容; (−) 不可
| タンパク質 翻訳システム |
DNA 環状 |
DNA 直鎖状 |
RNA | プロモーター | CMMaによる シグナル切断 グリコシレーション |
RBSb | 収量 (50µl 反応) |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 真核生物系 | |||||||
| TnT® Reticulocyte Lysate | yes | yesc | yes | T7, T3, SP6d | yes | no | 〜150-300nge |
| TnT® Wheat Germ Extract | yesf | yesc | yes | T7, T3, SP6d | nog | no | 〜150-300nge |
| TnT® SP High-Yield | yes | yes | yes | SP6 | nog | no | 10-100µg/ml |
| Rabbit Reticulocyte Lysate | no | no | yes | no | yes | no | 〜50-200nge |
| Wheat Germ Extract | no | no | yes | no | nog | no | 〜30-150nge |
| Wheat Germ Extract Plus | no | no | yes | no | nog | no | 〜10-80µg/mle |
| 原核生物系 | |||||||
| E. coli S30 Circular | yes | no | no | strong E. colih | noi | yes | 〜100-250nge |
| E. coli S30 Linear | yes | yes | yes | strong E. coli h (DNAのみ) |
noi | yes | 〜100-250ng (RNAでは効率が落ちます)e |
| E. coli T7 S30 Circular | yes | no | no | T7 or strong E. coli | noi | yes | 〜300nge |
a CMM＝Canine Microsomal Membranes.
b RBS=ribosome binding site (リボゾーム結合サイト)
c T7のシステムでは直鎖状のDNAが最適です。
d プロモーターの選択が重要です。
e システムに添付されたコントロール翻訳反応の場合（標準反応量50µl）。目的のタンパク質によって収量が変わります。
f T7のシステムを使用する場合、プラスミドを直鎖状にする必要があります。
g プロセシングには、タンパク質が小胞と結合、signal recognition particle (SRP) との相互作用が必要です。小麦胚芽エキストラクトの調製過程でのEDTA処理でSRPが除去されてしまうため、プロセシング実験を行うためには外因性SRPの添加、EDTA処理の削除などの最適化が必要です。
h スーパーコイル非感受性大腸菌プロモーターのみ使用可能。
i バクテリアによってはβラクタマーゼ遺伝子をプロセシングします。
in vitro 翻訳システムのアプリケーション
| 用 途 | TnT® Reticulo- cyte | TnT® Wheat Germ | Reticulo- cyte Lysate | Wheat Germ | Wheat Germ Plus | S30 Circular | S30 Linear | T7 S30 Circular | Gold TnT® / TnT® Quick | TnT® for PCR | TnT® SP6 High-Yield |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| プラス−ドDNAを用いた翻訳 | +++ | ++ | − | − | − | ++ | ++ | ++ | +++ | + | +++ |
| PCR産物を用いた翻訳 | ++ | ++ | − | − | − | − | ++ | − | ++ | +++ | +++ |
| RNAを用いた翻訳 | + | + | +++ | +++ | +++ | − | + | − | + | + | + |
| クローン化遺伝子の確認 | +++ | +++ | ++ | ++ | +++ | ++ | ++ | ++ | +++ | + | +++ |
| タンパク質/タンパク質相互作用 | +++ | +++ | ++ | ++ | +++ | ++ | ++ | ++ | +++ | +++ | +++ |
| タンパク質/DNA相互作用 | +++ | +++ | ++ | ++ | +++ | ++ | ++ | ++ | +++ | +++ | +++ |
| プロテイントランケーションテスト | ++ | ++ | + | + | + | − | − | − | ++ | +++ | +++ |
| 変異導入分析 | +++ | +++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | +++ | +++ | +++ |
| 薬剤スクリーニング（翻訳阻害など） | ++ | ++ | +++ | ++ | ++ | +++ | ++ | ++ | +++ | +++ | +++ |
記号：(+++) 推奨; (++) 許容; (+) 可能; (−) 不可
タンパク質／DNA相互作用
|
タンパク質の機能解析からcDNAをスクリーニング
|
タンパク質／タンパク質相互作用
|
遺伝子変異検出
|
