抗体医薬開発ツールガイド

免疫の働きを光で精密測定 抗体医薬開発ツールガイド 免疫学研究からバイオ医薬の開発・品質管理まで プロメガのソリューション： – 品質管理された細胞の利用で、安定した結果を実現（事前の細胞管理・準備の手間を省力化） – 高感度な発光アッセイ系による明瞭な結果 抗体/ 細胞医薬の開発・品質管理 に最適！ バイオアッセイ製品マップ HiBiT 発現 ターゲット細胞 レポーター導入 エフェクター細胞 RE ルシフェラーゼ は LDH HiBIT HiBiT 発現 ターゲット細胞 11 アミノ酸の発光性ペプチドとの融合タンパク質（HaloTag® または LDH） を恒常的に発現する細胞。細胞死により、HiBiT 融合タンパク質は漏出し、 ターゲット細胞特異的なセルキリングを高感度に測定可能 Casp 3/7 LDH LDH DNA DNA 細胞内マーカーの漏出 発光 （NanoBiT® 再構成） Glo 発光なし NanoLuc® 細胞外 NanoLuc® 阻害剤 HiBiT 融合 タンパク質マーカー HaloTag® HiBiT または LDH ※ CD19 CD20 Target Antigen 検出試薬 （LgBiT 他） 細胞死マーカーの測定 ・・・・・・・　11 ページ 1 HiBiT ターゲット セルキリング（TCK） ・・・・・・・　4 ページ 2 バイスタンダー キリングアッセイ ・・・・・　11 ページ 4 C1q 結合アッセイ ・・・・・・・　9 ページ A NanoLuc® 発光基質 （細胞透過性） 発光あり エンドサイトーシス 内在化アッセイ ・・・・　10 ページ 3 プロモーター HaloTag® または LDH HiBiT 抗体/ 細胞医薬の開発・品質管理 に最適！ バイオアッセイ製品マップ 近年、バイオロジックス（生物学的製剤）には多様なモダリガは、抗体医薬、細胞治療薬など多様なバイオロジックス新規な発光免疫検出システムを利用することにより安定か Glo レポーター導入 エフェクター細胞 T 細胞をはじめとする免疫細胞の活性化に重要な転写因子に関連する応答 配列が導入されており、各種免疫系のシグナルをルシフェラーゼの発現に 変換することにより定量します。 C1q ペイロード ADC Fc Fc γ Receptor 二重特異性抗体/ T 細胞エンゲージャー（BiTE） 阻害（共抑制） MHCII CD28 APC CD80/86 TCR/CD3 Co-Stimulatory Receptor Receptor- Activating Agonist Antibody Membrane Ligand Soluble Ligand TCR Activator TCR Co-inhibitory Ligand Anti- Receptor Co-inhibitory Receptor Anti- Ligand 中和抗体 サイトカイン& 成長因子 応答配列 RE ルシフェラーゼ 初代培養 エフェクター細胞 ・・・・・・・・・・　5 ページ 6 T 細胞活性化アッセイ ・・・・・・・・　7 ページ 7 免疫チェックポイントアッセイ ・・・・・・・・・・　7 ページ 5 ADCC & ADCP レポーター バイオアッセイ ・・・・・・・・・　6 ページ 8 サイトカイン & 成長因子 バイオアッセイ ・・・・・・・・・　7 ページ 9 細胞ベースアッセイ Lumit® イムノアッセイ Fc 受容体 結合アッセイ ・・・・・・・・・・・・・　9 ページ B サイトカインアッセイ ・・・・・・・・・・・ 8 ページ C 活性化 CAR-T （共刺激） モノクローナル抗体 リティが採用され、開発や品質管理は低分子創薬よりも薬剤の作用機序（MOA）に基づく定量的で正確かつ再現性の高い測定法が求められています。プロメ スの特性評価・開発に対応する高精度のバイオアッセイを提供しています。これらのアッセイでは、分子設計され、厳密に品質管理されたレポーター細胞や、 かつ精密な細胞実験を可能にします。 さらに、創薬支援サービスとして既存のバイオアッセイのカスタマイズや新規アッセイ系構築なども承っています。 共培養系のペインポイントを解決! ターゲットセルキリング（TCK） 初代培養細胞に依存する従来のADCC 法およびADCP 法は、細胞の入手が煩雑で、結果のばらつ きも大きいため、バイオ医薬品開発において課題のひとつになっています。さらに、免疫療法薬 の重要なメカニズムである標的細胞殺傷において、ターゲット細胞死とエフェクター細胞死を区別 でき、高感度で再現性よく測定することは非常に重要です。 プロメガが提供するターゲットセルキリング（TCK）バイオアッセイは、様々なバイオ医薬品によって 誘発されるTCK を測定するためのシンプル、高感度、特異性の高い方法です。従来の共培養アッ セイ系では見過ごされていた差をより明瞭に提示する可能性があります。これらのアッセイではター ゲット細胞からのみ生じる細胞死シグナル（発光）を標準的なルミノメーターを使用して測定します。 製品形態：基本的なキットは、HiBiT 導入ターゲット細胞、発光検出試薬および培地で構成されてい ます（キットによってコントロール抗体など添付）。キットに含まれる細胞は融解後すぐに使用できる 使い切りのThaw and Use 細胞ですが、増殖やバンキングが可能なCell Propagation Model （CPM） も 別途ご利用いただけます。 HiBiT ターゲットセルキリングの特性 • 高感度に標的細胞特異的な細胞傷害を測定 • 培地交換のない、シンプルなホモジニアスアッセイ • 標的細胞は発光性タグHiBiT 発現細胞として、あるいは自作用キットとして入手可能 TCK アッセイの原理 漏出した HiBiT マーカーのみを発光させて、 ターゲット細胞死に応じた発光シグナルを 測定。 HiBiT ターゲット細胞を用いて実証された CAR-T 活性 CAR-19 またはGFP コントロールをレンチ ウイルスで形質導入したT 細胞を、HiBiT ターゲット細胞（Ramos）と異なるエフェク ター：ターゲット（E：T）比で共培養し、24 時間インキュベートした。 PBMC ADCC Bioassay を用いて測定され たTCK 活性 抗がん抗体医薬リツキシマブによる、 PBMC を介したRaji（HiBiT）ターゲット細胞 への傷害活性 CAR-T 細胞による細胞傷害活性抗体依存性細胞傷害活性（ADCC） ターゲット細胞に特異的な細胞傷害活性を 測定するTDCC Assay TDCC 試験適合のヒトT 細胞（CD8+）を、 HiBiT 発現ターゲット細胞および適切な二 重特異性T 細胞エンゲージャー（BiTE）と 組み合わせて測定。 ターゲット細胞の貪食による細胞傷害活性 を定量するMacrophage ADCP Bioassay ADCP 適格ヒトマクロファージを、HiBiT ター ゲット細胞およびトラスツズマブと組み合 わせて、ADCP 活性を測定。 T 細胞依存性細胞傷害活性（TDCC） 抗体依存性細胞貪食活性（ADCP） 細胞の“死”を精度よく測定 エフェクター作用 HiBiT マーカーの恒常発現 ターゲット細胞の死 HiBiT マーカーの 漏出 発光 HiBiT 発光マーカー （11 アミノ酸） ターゲットセルキリングの細胞発光イメージング SKOV3 （HiBiT）細胞に対し、50 ng/ml のrunimotamab、およびTDCC 試験適合のヒトT 細 胞（ CD8+）（Cat. # CS3055B03）を、エフェクター細胞対ターゲット細胞の比率2：1で処 置した。発光の検出は、Bio-Glo-NB™ TCK LgBiTタンパク質（ Cat.# JB1001）、Nano-Glo® Vivazine® 基質（Cat.# N2580）を使用し、GloMax® Galaxy 細胞発光イメージャー（Cat.# GM4000）で測定した。小さな円形の細胞がT 細胞であり、より大きな接着細胞が SKOV3（ HiBiT）細胞。 LgBiT TCK バイオアッセイの測定操作 ターゲット細胞 （HiBiT 導入TCK 細胞） エフェクター細胞+ 被験バイオ医薬品（+/-） 検出試薬 プレートリーダーで 測光 インキュベート （O/N） 共培養 （4 ～ 72 時間） インキュベート （10 分間） BiTE GloMax® Galaxy CAR 4 HiBiT- TCK 細胞は自作可能! HiBiT マーカーを発現するTCK 細胞は、ご自身の実験目的に最適な細胞に HaloTag-HiBiT mRNA または短鎖HiBiT 配列のノックイン（ゲノム編 集）で導入することで作製でき、ターゲット細胞と共培養することによりターゲットセルキリングアッセイを実施することができます。 CAR-T 細胞の効力評価アプリケーションに関するウェビナー! CAR-T 細胞の生体内作用機序は多面的であり、ターゲット細胞殺傷とサイトカイン誘導は、CAR-T 細胞治療の指標とし て特に注目されている測定法です。本ウェビナーでは、既存の測定手法の限界について解説し、新しいHiBiT による標 的細胞殺傷を基盤としたアプローチをご紹介するとともに品質管理（QC）環境での使用に向けたアッセイの性能評価に ついても解説します（ 英語、要登録）。 ViaScript®（ HiBiT） TCK バイオアッセイ法を用いた乳癌パネル解析 1 日目：ViaScript® 試薬によるHaloTag-HiBiT mRNA のトランスフェクション。2 日目： Ertumaxomab（HER2 X CD3）の濃度を変えながらCD8+ T 細胞とターゲット細胞（E：T 比10：1） を混合。3 日目、Bio-Glo-NB™ TCK 試薬を添加後、発光測定を実施。HER2 発現量（高→低） は以下の通り：SKBR3、MCF7、MDA-MB-231、MDA-MB-468（HER2陰性）。ViaScript®（ HiBiT） TCK バイオアッセイは、複数のターゲット細胞タイプを同時にスクリーニング可能であり、 作業負荷を大幅に軽減します。 19711MA 0 1 × 108 5 × 107 Log[Ertumaxomab] (g/ml) Luminescence (RLU) SKBR3 MDA-MB-231 MCF7 MDA-MB-468 –11 –10 –9 –8 –7 –6 –5 初代培養 エフェクター細胞 プロメガの一次エフェクター細胞は、抗体やバイオ医薬品の力価・安定性を高精度に評 価できる発光バイオアッセイ用の細胞です。ADCC、ADCP、TDCC などの作用機序に基づ いて設計され、生物学的に高い関連性を有します。HiBiT ターゲットセルキリングアッセイ で機能確認されており、ターゲット TCK 細胞の溶解後に検出試薬を加えることで、特異 的な細胞傷害性を明るい発光シグナルとして定量的に測定することができます。PBMC CD8+ T cells Mφ HiBiT 導入 ターゲット細胞 固形がん血液がん 卵巣がんOVCAR3 および SKOV3 ・ 発現：HER2, MSLN, 5T4, MUC16 ・ MSLN ノックアウト株あり B 細胞リンパ腫・ 白血病 Raji およびRamos ・ 発現：CD19, CD20, CD22,CD38 ・ 一部標的に対してノックアウト株 あり 乳腺腺がんSK-BR-3 ・ 発現：HER2, EpCAM 骨髄性白血病U937 および K562 ・ 発現：CD33, CLL-1 肺がんA549 ・ 発現：EGFR 多発性骨髄腫H929 ・ 発現：BCMA, CD38 メラノーマA375 ・ 発現：HER2, CD70, B7-H3 T 細胞性白血病T2 ・ 発現：CD5, CD7, CD30, CD52 HiBiT 導入ターゲット細胞作製ツール RNA導入法 ViaScript®（ HiBiT） TCK Bioassay ・ RNAトランスフェクションによる一過性 HiBiT 発現 ・ 最適なTCK 細胞株の選定 ・ 血液がんまたは固形がん細胞株のHiBiT 化に ゲノム編集法※ CRISPR ノックインによる導入については弊社までお問い合わせください。 初代培養エフェクター細胞 ADCC 適格PBMC ・ 機能試験済み ・ 単一ドナー由来 ・ Fc γR 遺伝子型判定済み TDCC 適格CD8+ T 細胞 ・ 機能試験済み ADCP 適格マクロファージ ・ 機能試験済み ・ Fc γR 遺伝子型判定済み 定量試薬 ADCC、TDCC、 CAR-T 用 Bio-Glo-NB™ TCK Luciferase Assay System ADCP 用Bio-Glo-NB™ Lytic Luciferase Assay Systems ※以下については弊社までお問合わせください。 • ターゲット、エフェクター細胞、定量試薬など必 要な試薬を含むキット • CD19、CD20 ノックアウトターゲット細胞 • ご自身のターゲット細胞の HiBiT TCK 化、ノック アウト細胞作製など 製品情報 製品の詳細・価格等については最終ページのQR コードの資料をご覧いただくか、弊社テクニカルサービスまでお問い合わせください。 ※オリジナルのバイオアッセイの構築については弊社TRS（カスタムアッセイ開発サービス）がご利用いただけます。 5 精度、安定性に優れるレポーター細胞 レポーターバイオアッセイ 本アッセイは免疫細胞の活性化をそれぞれ特異的なシグナル経路を利用してルシフェラーゼ遺伝子 の発現としてアウトプットさせることで安定・高感度に検出します。 初代細胞のバラつきを排除し、数週間にわたる工程を最短6 時間に短縮します。プロメガのMOAベー スアッセイは、ICH ガイドライン準拠の信頼性と糖鎖修飾等の微差を見抜く高感度を両立します。R&D からCMC まで一貫したデータを提供する「試薬としての細胞」が、抗体創薬を劇的に効率化します。 製品形態：キットには改変エフェクター細胞、発光検出試薬および培地を基本とし、キットによってコン トロール抗体などが含まれます。キットに含まれる細胞は使い切りのThaw and Use 細胞ですが、増 殖やバンキングが可能なCell Propagation Model（CPM）も別途ご利用いただけます。 代表的なレポーターバイオアッセイの操作フロー ターゲット細胞 エフェクター細胞 （レポーター細胞） 検出試薬 プレートリーダーで 測光 被験抗体を 添加 インキュベート （6 時間） インキュベート （5 ～ 10 分間） 抗体のグリコシル化による生物活性の変化に関する ADCC レポーターアッセイ と 従来法の比較 未処理（完全にグリコシル化）とPNGase F 処理したトラスツズマブを適切な割合で 混合したサンプルをHER2 陽性SK-BR-3 細胞で評価した。ADCC レポーターアッセ イの場合はキットに添付のJurkat エフェクター細胞を使用した。従来法である PBMC ベースのADCC アッセイではドナー由来のPBMC をエフェクターとし、溶解 したSK-BR-3 細胞から漏出したLDH をCytoTox 96® 非放射性細胞傷害性アッセイ を用いて測定した。 11427MB Percent ADCC Biolocigical Activity (Relative to N-glycosylated trastuzumab) Percent N-glycosylated trastuzumab 0 10 20 30 40 50 0 20 40 60 80 100 120 ADCC Reporter Bioassay 細胞死を指標とする従来法 レポーターバイオアッセイの精度（ ADCC レポ―タ―バイオアッセイの場合） パラメーター結果 WIL2-S ターゲット細胞Raji ターゲット細胞 精度 % 予測相対力価% 回収率% 回収率 50 97.7 101.0 75 88.5 101.2 125 98.4 93.8 150 98.4 96.7 反復精度（ %CV） 5.0 9.1 中間精度（ %CV） 7.3 3.0 直線性（ r2） 0.995 0.997 直線性 （y=mx+b） y=1.016x-0.052 y=0.922x+5 レポーターバイオアッセイの抗体医薬パイプラインでの利用 ステージ利点 開発受容体結合の迅速なスクリーニングやランク付け 最適化特定の機能プロファイルをもとにしたドメイン設計など 前臨床精度、直線性、再現性が認められたレポーターバイオアッセイ 薬事各機能の直交的確認のためのブリッジング研究 製造効力試験のためのロットリリースアッセイとして Luciferase NFAT-RE Light Target Antigen NFAT Signaling Pathway Target Cell Bio-Glo™ Luciferase Assay 製品ラインナップ： ・ Human ADCC FcγRIIIa （ V158 and F158 variants） ・ Human ADCP FcγRIIa（ H131 and R131 variants）, FcγRI, FcγRIIb ・ Mouse ADCC FcγRIV, FcγRIII ・ Mouse ADCP FcγRI, FcγRIIb ・ Cynomolgus ADCC FcγRIII ・ Cynomolgus ADCP FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb ・ Canine ADCC FcγRIII ADCC およびADCP レポーターバイオアッセイは、Fc γ受容体に特異的に結合して活性化させる抗体ならびにその他のバイオ医薬品の有効性 と安定性の測定に利用できる生物学的に関連する作用機序ベースのアッセイです。本アッセイには、関連するFc γ受容体バリアントとNFAT 応答配列により駆動するルシフェラーゼ遺伝子を安定して発現する エフェクター細胞が含まれます。 ※ 従来のADCC Assay の改良版については4 ページをご参照ください。 250,000 200,000 150,000 100,000 50,000 0 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 Luminescence (RLU) Log [Ab g/mL] ADCC Trastuzumab Deruxtecan Trastuzumab Trastuzumab Emtansine Trastuzumab Deruxtecan/HER2KO Trastuzumab/HER2KO Trastuzumab Emtansine/HER2KO ADCC レポーターバイオアッセイを用いたADC のFc エフェクター活性の測定 trastuzumab（ 抗HER2 モノクローナル抗体）、trastuzumab emtansine またはtrastuzumab deruxtecan の連続希釈液を、ADCC バイオアッセイエフェクター細胞とSKOV3 またはSKOV3/ HER2 ノックアウトターゲット細胞とともに、37℃で6 時間インキュベートした。 1 Fc エフェクターバイオアッセイ（ ADCC / ADCP） エフェクター細胞 活性化 応答配列 レポーター遺伝子 レポータータンパク質の 刺激 発現 （抗体の結合など） 細胞の“活”を精度よく測定 6 製品の詳細・価格等については最終ページのQR コードの資料をご覧いただくか、弊社テクニカルサービスまでお問い合わせください。 2 T 細胞活性化バイオアッセイ T 細胞応答を誘導、強化、または操作することを目的とした免疫療法戦略は、がんや自己免疫疾患などの疾患の治療における有望なアプロー チです。T 細胞活性化バイオアッセイ（NFAT およびIL-2）は、それぞれ遺伝子改変された細胞株であるTCR/CD3 エフェクター細胞（NFAT） およびTCR/CD3 エフェクター細胞（IL-2）から構成されています。抗TCR/CD3 刺激単独、または抗TCR/CD3 と抗CD28 の両方の刺激と結合 すると、受容体を介したシグナル伝達が（それぞれNFAT またはIL-2 経路の活性化を介して）発光を誘導します。この発光は、Bio-Glo™ 試 薬を添加し、ルミノメーターで定量することで検出できます。 T Cell Activation Bioassay （NFAT） による安定性試験 ブリナツモマブのサンプルを4℃（対照）で1 時間維持するか、熱処理（42℃または65℃）し た後、T 細胞活性化バイオアッセイ（NFAT）とRaji（CD19+）標的細胞を用いて分析した。 13795MA –4 –2 0 2 4 0 0.2 × 107 0.4 × 107 0.6 × 107 0.8 × 107 1.0 × 107 1.2 × 107 Log10[blinatumomab], pM Luminescence (RLU) 4°C 42°C 65°C Luciferase IL-2 Promoter Bio-Glo™ Luciferase Assay Light TCR/CD3 Effector Cell (NFAT or IL-2) Fc RIIIa Ectodomain Target Antigen Target Cell Transfected CAR-T Construct CD3 Signaling Domain Luciferase NFAT-RE OR Anti-Target 製品ラインナップ： ・ TCR/CD3 （NFAT）, TCR/CD3 （IL2） effector cells ・ TCR αβ -KO （CD4+）, TCR αβ -KO （CD8+）, TCR αβ -KO （CD4+, CD8+） cell lines ・ V γ 9 δ 2 T Cell Activation Bioassay（γδT cell therapy） 3 免疫チェックポイント調節（共刺激・共抑制）バイオアッセイ 作用機序（MOA）に基づくレポーターバイオアッセイは、免疫チェックポイントの共抑制性受容体および共刺激性受容体を、それぞれ単独ま たは組み合わせて解析できるように設計されています。このバイオアッセイは、通常、2 つの遺伝子改変細胞株から構成されています。1） 受容体を発現するエフェクター細胞、および 2）リガンドを発現する人工抗原提示細胞（aAPC）です。共培養中、TCR はTCR 活性化因子ま たは抗原提示によって活性化され、リガンドと共抑制受容体の相互作用がTCR シグナル伝達を阻害します。抗体が存在すると、共抑制受容 体とリガンドの相互作用が阻害され、その結果、抑制が解除されます。 Luminescence (RLU) Log10 [Ab], μg/ml –3 –2 –1 0 1 2 3 3.5×104 3.0×104 2.5×104 2.0×104 1.5×104 1.0×104 5.0×103 0 0 #12 $&%’ ( )*+&!, – 3 / )’ 4 5#67 !- !7 )*%8!, – . / 7 9′ 85&: &%’ ( )*+&!, – . / anti-CTLA-4 (ipilimumab) anti-HER2 (Trastuzumab) anti-PD-1 (Nivolumab) anti-TIGIT CTLA-4 Blockade Bioassay による各種抗体の力価測定 CTLA-4/CD80 およびCD86 の相互作用を阻害するように設計された生物学的製剤の作用機序 （MOA）と特異性を反映した。 Luciferase Promoter Bio-Glo™ Luciferase Assay Light Anti-Receptor TCR Activator Co-Inhibitory Ligand Co-Inhibitory Receptor Anti-Ligand TCR Co-Inhibitory Effector Cell Co-Inhibitory aAPC Cell 製品ラインナップ： ・ 共抑制レポーターバイオアッセイ （PD-1, CTLA-4, TIGIT, TIM-3, VISTA, HVEM, CD226, LAG-3/MHC-II） ・ 共刺激 レポーターバイオアッセイ （GITR, OX40, CD40, 4-1BB, CD27, CD28, ICOS） ・ コンビネーションレポーターバイオアッセイ （PD-1+TIGIT, PD-1+CTLA-4, PD-1+LAG-3, PD-1+4-1BB） 4 サイトカイン・成長因子 バイオアッセイ サイトカインおよび成長因子バイオアッセイは、リガンドの活性を定量およびモニタリングするだけでなく、抗体を介したリガンドと受容体の 結合の遮断にも適したルシフェラーゼレポーターベースのアッセイです。これらのバイオアッセイは、サイトカインおよび成長因子のバイオ シミラーおよびバイオベターの製造における開発、安定性試験、および力価測定のための貴重なツールとなります。 15042MA –4 –3 –2 –1 0 1 0 1 × 105 2 × 105 3 × 105 4 × 105 Log10[Ab], μg/ml Log10[Ab], μg/ml Luminescence (RLU) Luminescence (RLU) Aflibercept Bevacizumab Ranibizumab Adalimumab –3 –2 –1 0 1 2 0 2 × 105 4 × 105 6 × 105 8 × 105 Ramucirumab Anti-KDR Ab A. VEGF バイオアッB.セイの応答性 様々なVEGF 経路阻害剤の効果を、EC80 濃度の組換えVEGF 存在下で測定。 Bio-Glo™ Luciferase Assay Luciferase Response Element No Ligand/Blocked Ligand = No Signal Cytokine Receptor Cytokine Dimer No Light 製品ラインナップ： ・ VEGF, RANKL, TNFα , TGFβ , IFN-α , IFN-β , IFN- γ ・ IL-2, IL-6, IL-12, IL-15, IL-17, IL-23 ※オリジナルのバイオアッセイの構築については弊社TRS（カスタムアッセイ開発サービス）がご利用いただけます。 7 洗浄不要のハイスループット対応イムノアッセイ Lumit® イムノアッセイ In vitro での 標的タンパク質の検出と定量には、特異性の高い抗体を利用したウェスタンブロッ ティングや ELISA などのイムノアッセイが利用されますが、洗浄操作やブロッキングなどの煩雑な操 作が求められます。Lumit® テクノロジーは、マルチウェルプレートフォーマットで試薬を加えるだけ のホモジニアスイムノアッセイを実現できるので、洗浄が不要なために操作がシンプルで自動化や ハイスループットスクリーニングにも容易に適応します。蛍光を利用した FRET 様のイムノアッセイ に比べてもより簡便、広いダイナミックレンジ、低コストでの実施が可能で、基礎研究から創薬研 究を行う研究者にとって強力なツールとなります。 • 真のホモジニアスアッセイ：洗浄工程、ブロッキング、抗体の固定化が不要で、培地の除去も 不要な“添加だけ”のステップ • ハイスピード：ステップ数が最小限で細胞培養プレートでの測定も可能 • 多検体処理：自動化にも容易に適応し、384 ウェルフォーマットにも対応 • 高品質データ：発光法の特性により高感度・広いダイナミックレンジを実現 （サンプルの希釈不要） Lumit® サイトカインアッセイの原理 高輝度NanoLuc® 発光酵素を分割したSmBiT とLgBiT で測定対象に対する2 種類の抗体 をそれぞれ標識。サンプルにこれらの抗体 および基質を加えると含まれる標的に比例 した発光量が得られる。 代表的なLumit® アッセイの操作フロー 測定対象サンプルに Lumit® 抗体を添加 標的タンパク質に 2 種の抗体が結合し NanoBiT が再構成検出試薬 プレートリーダーで 測光 インキュベート （60 分間） インキュベート （5 分間） 17346MD Samples can be cultured cells or transferred media. Add antibody mixture. Add Lumit® detection reagent B. Measure luminescence. Sample Plate Total assay time: 70 minutes 17346MD Samples can be cultured cells or transferred media. Add antibody mixture. Add Lumit® detection reagent B. Measure luminescence. Sample Plate Total assay time: 70 minutes Lumit® サイトカインイムノアッセイ Lumit® Cytokine Detection Immunoassay は、洗浄操作を必要としないシンプルなイムノアッセイプロトコルで、培養細胞サンプル中のサイトカ イン・成長因子を高感度に定量します。SmBiT またはLgBiT で標識済み抗体をサンプルに加え、さらに検出試薬を加えて混合し、標準的な プレートリーダーで発光シグナルを測定するだけで、解析が完了します。全プロトコルは70 分以内に完了し、培養中の細胞を用いて直接アッ セイを実施することも、培養上清を別のプレートに移して測定することも可能です。試薬を加えるだけの単純な操作により384 ウェルプレー トでのホモジニアスアッセイやマルチプレックスアッセイも実現できます。 0 5,000 10,000 15,000 20,000 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 IL-2 (pg/ml) Cell Stimulation Cocktail 0 2.5 × 105 5.0 × 105 7.5 × 105 0 1,000 2,000 3,000 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 Viability (RLU) Cytotoxicity (RFU) Cell Stimulation Cocktail A. B. 17934MA ◀ 同一ウェルでのヒトPBMC のIL-2 放出、細胞毒性、生存性 マルチアッセイ PBMC（細胞30,000 個/ ウェル）を96 ウェルプレートに播種し、 Cell Stimulation Cocktai（l CSC）の濃度を変えて24時間刺激。処 理後、CellTox™ Green で蛍光を測定して細胞毒性を評価し（B） 、室温平衡後にLumit® 試薬でIL-2 放出を測定（A）、最後に CellTiter-Glo® で生存率（発光）を測定した（B） 。 測定項目関連するイベント IFN-β 抗ウイルス / 自然免疫センシング経路 （STING、RIG-I、TLR7/9） IFN-γ T 細胞 / NK 細胞の機能・活性 （共培養、細胞傷害アッセイ） IL-1β インフラマソーム / NLRP3 生物学 （パイロトーシス、カスパーゼ-1） IL-2 T 細胞の増殖・生存 / 拡大 （CAR-T、TCR-T、Treg 機能） IL-4 免疫スキューイング（Th2 vs Th17 vs 制御性） IL-6 サイトカイン放出 / CRS（サイトカイン放出症候群） リスク、（細胞治療、エンゲージャー、PBMC アッセイ） IL-8 腫瘍微小環境のセクレトーム / トラフィッキング 測定項目関連するイベント IL-10 抗炎症シグナル / 免疫抑制 （Treg、M2 マクロファージ、TAM） IL-12p70 樹状細胞活性化 / アジュバント・ワクチンプログラム IL-17A 免疫スキューイング（Th2 vs Th17 vs 制御性） IL-18 インフラマソーム / Th1–NK 活性化および IFN-γ 誘導（カスパー ゼ-1、IL-12 との相乗効果） TNF-α 自然免疫炎症 / 抑制 （マクロファージ、NF-κB、TLR 生物学） VEGF-A 血管新生 / 低酸素 / 血管生物学 HMGB1 免疫原性細胞死（ICD） （腫瘍学、化学療法/ 免疫腫瘍学、放射線モデル） 測定対象 SmBiT LgBiT ※上記測定項目に対応するLumit® イムノアッセイについては弊社までお問い 合わせください。 In vitro での簡便& 高感度測定 8 Lumit® 結合アッセイ（FcR・C1q） Lumit® Binding Assay は、抗体医薬の機能評価において重要なFcγR（Fc 受容体）およびFcRn（新生児Fc 受容体）や補体成分C1q との 結合親和性を、迅速かつ高精度に測定できる革新的なプラットフォームです。独自の分割型ルシフェラーゼ技術NanoBiT® を応用したホモジ ニアス発光アッセイ法を採用しており、従来のELISA 法とは異なり、プレートへの固定化や洗浄工程が一切不要です。検体と試薬を混合す るだけで、液相中での分子間相互作用を反映した発光シグナルが得られます。エフェクター機能（ADCC / ADCP 活性）に関わるFcγR、血中 半減期に関与するFcRn、さらに補体依存性細胞傷害（CDC）の起点となるC1q への結合評価を同一の操作フローで実施可能です。バイオ シミラー開発や品質管理における多検体解析を強力に効率化します。 Lumit Fc Receptor （FcR /FcRn） Binding Immunoassay 本アッセイは競合法にて、抗体医薬のエフェクター機能（Fc）や血中滞留性（FcRn）を左右する受容体との結合能を評価します。LgBiT 標識 トレーサー抗体とSmBiT 標識受容体の結合による発光を基準シグナルとし、非標識の検体抗体が存在すると、検体濃度に依存して発光値が 低下します。このシグナル変化から、固相への固定化を伴わない溶液中での受容体結合能を定量します。 Lumit® Fc γ R 結合免疫測定法の原理 トレーサー（LgBiT 標識IgG）とFc γ R 標的（SmBiT タグ付受容体） の相互作用を示す。競合する被験 IgG が存在する場合、発光 は比例して減少する。 30 minutes OR Fc R-SmBiT Sample Tracer-LgBiT LgBiT SmBiT [Sample] NanoBiT® Luciferase Luminescence (RLU) Lumit® C1q Binding Assay モノクローナル抗体のFc 領域はC1q との結合を介して補体経路を活性化し、補体依存性細胞傷害（CDC）などの作用を発揮します。本アッ セイは、CDC 活性の起点となる補体成分C1q と、抗体Fc 領域との結合を評価します。LgBiT 標識されたC1q、ターゲットとなる抗体、およ びSmBiT 標識された抗IgG Fab 複合体を混合するホモジニアスな系により、簡便に測定できます。抗ヒトIgG Fab–SmBiT 複合体で抗体を捕 捉してFc クラスタリングを誘導し、C1q–LgBiT を添加することでNanoBiT® ルシフェラーゼを再構成する、洗浄工程不要のホモジニアスアッ セイです。固相固定化・洗浄を必要としないため、C1q との結合評価スクリーニングや品質管理に迅速に適用できます。 Lumit® FcR Binding Assay によるADC の特性比較 各種ADC は、対照IgG または非結合（無修飾）のトラスツズマブと並行してLumit FcR 結合アッセイで試験した。Enhertu（エンハーツ）と Kadcyla（カドサイラ）は、対照 IgG と比べて Fc γ RIIa およびFcRn への結合性が低く、Enhertu のみが他の抗体よりもFc γ RIIIa への結合性が低かった。 Human C1q-LgBiT Streptavidin-SmBiT Anti-IgG Fab-biotin IgG Antibody (Test Sample) Log10[Antibody concentration] (nM) Fold Induction 80 100 120 20 –2 –1 0 1 2 3 40 60 0 Rituximab Non-fucosylated rituximab Non-glycosylated rituximab Rituximab IgG2 isotype Rituximab IgG3 isotype Rituximab IgG4 isotype （左）Lumit® C1q 結合アッセイの原理 ビオチン化抗ヒトIgG Fab をストレプトアビジン -SmBiT と複合体化。次にC1q-LgBiT を添加。LgBiT とSmBiT が近接するとNanoBiT® ルシフェラーゼ が再構成され、C1q に結合した抗体の量に比例し た発光シグナルを生成。 （右）Lumit C1q 結合アッセイの優れた特異性 Lumit® C1q 結合アッセイは、抗体の特異性と感度 について評価可能。様々なIgG アイソタイプやフ コシル化、糖鎖修飾を含むリツキシマブのバリアン トパネルに対して実施。その結合プロファイルは、 既存の文献と一致した。 Lumit® FcRn Assay Lumit® Fc γ RIIa（H131）Assay Lumit® Fc γ RIIIa（V158）Assay 400,000 300,000 200,000 350,000 250,000 150,000 100,000 50,000 0 0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10 100 1,000 10,000 RLU Signal Competitor (μg/mL) Control lgG Enhertu Kadcyla IC 13.72 50 (μg/mL) 70.28 8.324 Trastuzumab 12.55 Control lgG Enhertu Kadcyla Trastuzumab 200,000 150,000 100,000 50,000 0 0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10 100 1,000 10,000 RLU Signal Competitor (μg/mL) Control lgG Control lgG Enhertu Enhertu Kadcyla Kadcyla IC 1.251 50 (μg/mL) 17.54 17.41 25,000 20,000 15,000 100000 5,000 0 0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10 100 1,000 10,000 RLU Signal Competitor (μg/mL) Control lgG Enhertu Kadcyla IC 4.266 50 (μg/mL) 51.27 30.84 Control lgG Enhertu Kadcyla 400,000 300,000 200,000 350,000 250,000 150,000 100,000 50,000 0 0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10 100 1,000 10,000 RLU Signal Competitor (μg/mL) Control lgG Enhertu Kadcyla IC 13.72 50 (μg/mL) 70.28 8.324 Trastuzumab 12.55 Control lgG Enhertu Kadcyla Trastuzumab 9 19719MA Plate Assay Target Cells Add Ab Complexes Remove Culture Media Measure Luminescence 1 2 3 Add Detection Reagent 4 5 Incubate 4–14 hours Incubate 3 hours Incubate 3 minutes ADC 薬効メカニズムを深掘り! 内在化& バイスタンダー効果の解析 内在化の測定 Antibody Internalization Bioassay ADC の内在化の動態を開発初期段階で理解することは後期段階でのドロップアウトを回避する上で も非常に重要です。 Antibody Internalization Bioassay は、NanoLuc® ルシフェラーゼ標識抗Fc Fab フラグメントを用いて、 抗体の細胞内取り込みを高感度に測定します。膜透過性のないNanoLuc® 阻害剤を利用することで、 細胞外および細胞表面に結合した抗体由来のシグナルを消光させます。このアッセイは、わずか 30 分のインキュベーションで、細胞内に取り込まれた抗体のみを確実に測定することができます。 この手法により、プレートベースフォーマットで抗体の結合および細胞内取り込みを定量するため の、高感度かつハイスループットな方法が提供されます。 最新細胞アッセイ技術 Antibody Internalization Bioassay 測定原理（左） NanoLuc® ルシフェラーゼ標識抗 Fc Fab が一次抗体またはADC 治療薬に結合することに基づいている。一次抗体が標的抗原に 結合すると、複合体が内在化（ internalization）し、結合していな い抗体は洗浄除去される。膜透過性のないNanoLuc® 阻害剤 （Bio-Glo-NL™ Glo-Guard）およびNanoLuc® 阻害剤緩衝液（Bio- Glo-NL™ Glo-Guard 緩衝液、図中の黄色の網掛け部分）、およ び膜透過性ルシフェラーゼ基質を含む検出試薬を細胞に添加。 結果として得られる発光シグナルは、主に内在化したFab と一 次抗体の複合体から生成される。 測定プロトコル（下） 1）ターゲット細胞をプレートに播種。2）事前に複合体化させた 抗体と細胞をインキュベートし、細胞表面の抗原に結合、内在 化。3）インキュベート後、培地を除いて未結合の抗体を除去 することで、細胞表面に結合あるいは内在化した抗体のみが残 存。4）Bio-Glo-NL™ Glo-Guard を含む検出試薬を各ウエルに添 加。5）細胞外のNanoLuc® は阻害され、発光基質は細胞質やエン ドソーム膜に浸透するため、内在化した抗体量に比例した発光 シグナルが得られる。 内在化抗体由来の発光シグナルの測定 NanoLuc® Fab と複合体化したADC（Kadcyla®、Enhertu®、トラスツズマブ®、または対照 IgG）の滴定試験を実施した。ADC をNanoLuc®-Fab と2：1 の比率で15 分間インキュベー ト後、培地中で連続希釈し、SKOV3 細胞に添加した。3 時間インキュベート後、細胞を 1 回洗浄し、アッセイ試薬を添加した。初回発光測定後、ジギトニンで細胞を透過化させ、 細胞外NanoLuc® 阻害剤が内在化したNanoLuc®-Fab を阻害できるようにした。2 回の発 光測定値の差を細胞内NanoLuc® シグナルとしてプロットした。 GloMax® Galaxy による抗体内在化イメージング SKOV3 細胞をNanoLuc® 標識 Fab が結合したtrastuzumab とともにインキュベーションし た。緑：NanoLuc® 発光、赤：リソソームなどの酸性オルガネラ（LysoTracker® Deep Red 染色） 19718MA 内在化バイオアッセイの操作フロー ターゲット細胞の播種抗体・酵素複合体の添加培地の除去検出試薬の添加測光 プレートリーダーで 測光 インキュベート （3 分間） インキュベート （3 時間） インキュベート （4 ～ 14 時間） 0.000001 0.00001 0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10 101 102 103 104 105 106 Luminescent Signal from Intracellular NanoLuc-Fab [Primary Ab] (ug/ml) Luminescence Trastuzumab Control IgG Kadcyla Enhertu 内在化 ADC ペイロード バイスタンダーキリング Bio-Glo-NB™ 発光基質 Bio-Glo-NL™ 発光阻害剤 抗原またはNanoLuc® 標識抗体の リサイクリング 発光 リソソーム エンドサイトーシス NanoLuc® Fc Fab 抗原 非内在化 抗体 10 バイスタンダー効果の測定 HiBiT Bystander Killing Assay ADC は、抗原陽性細胞への直接的な殺傷に加え、細胞内で放出された薬物が周囲の抗原陰性細胞を死滅させる“バイスタンダー効果”とい う重要な作用機序を持ちます。これは、全ての細胞が標的抗原を発現しているわけではない不均一な腫瘍微小環境において、撃ち漏らしに よる治療抵抗性や再発を防ぐ上で極めて重要です。プロメガのHiBiT Bystander Killing Assay は、細胞死に伴い放出される発光性のタグ（HiBiT） を利用した非溶解型のアッセイです。混合培養という微小環境を模した系においても、特定の細胞集団の死のみを正確に捉え定量化できま す。本手法により直接的殺傷、バイスタンダー殺傷、オフターゲット毒性を明確に区別でき、ADC 設計の最適化を強力に支援します。 製品の詳細・価格等については最終ページのQR コードの資料をご覧いただくか、弊社テクニカルサービスまでお問い合わせください。 HiBiT 発現細胞を利用したバイスタンダーキリングの測定原理 A. ADC が、標的抗原（+） およびHiBiT （+）細胞に結合し、ペイロードを放出（本来の殺 傷効果） B. 標的抗原（-） HiBiT（ +）細胞の場合は細胞を殺さない（オフターゲット効果のみ） C. 標的抗原（+）およびHiBiT（-） 細胞と標的抗原（-）およびHiBiT（+）細胞でターゲット セルキリング（バイスタンダー効果） ロンカスタキシマブ・テシリンによるバイスタンダーキリングの検出 Raji 細胞に抗CD19 ADC である loncastuximab tesirine を段階希釈して加え、96 時間イン キュベートした後、Bio-Glo-NB TCK 検出試薬で細胞外HiBiT を検出した。青色：Raji/HiBiT 細胞の直接溶解を示し（EC50 = 1.7 ng/mL）。赤色：高濃度におけるCD19 ノックアウト （CD19KO）Raji/HiBiT 細胞のオフターゲット溶解を示した（EC50 = 78 ng/mL）。緑色： HiBiT を発現しないRaji 細胞と、CD19KO Raji/HiBiT 細胞を 8：1 の割合で混合した条件で、 バイスタンダー効果による溶解が観察された（EC50 = 1.7 ng/mL）。 A. 直接的な殺傷効果 HiBiT 発現細胞 HiBiT 非発現細胞 B. オフターゲット効果C. バイスタンダー殺傷効果 標的抗原 ADC ? ? -14 -12 -10 -8 -6 -5 0 5 10 15 20 25 HiBiT Target Cell Killing log [loncastuximab tesirine g/mL] Specific Lysis (%) WT Raji/HiBiT CD 19KO Raji/HiBiT WT Raji（no HiBiT） + CD 19KO Raji/HiBiT 細胞マーカー測定（ 細胞生存・細胞死アッセイ） 高感度で簡便なプロメガの細胞生存率およびアポトーシスアッセ イなら ADC ペイロードがターゲット細胞の生存および細胞死メカ ニズムに与える影響をエンドポイントまたはリアルタイムで把握す ることができます。 また、免疫原性細胞死（ICD）は、免疫系が腫瘍細胞を認識・攻 撃する能力を高めることで、ADC の治療効果を補完します。ADC はICD を誘導し、がん抗原の放出や免疫細胞の腫瘍部位への動 員を引き起こします。このプロセスは、ADC による直接的な細胞 殺傷効果を強化するだけでなく、腫瘍に対する持続的な免疫応答 の促進にもつながるため、ADC 療法の有効性向上における重要な メカニズムとされています。当社の専用アッセイを用いれば、 ADC 研究におけるICD の重要な役割を詳細に解析できます。 500 400 300 200 100 0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10 0 0 20 40 60 80 100 120 Cytotoxicity and Caspase 3/7 activity (% increase vs untreated controls) Viability (% of untreated controls) Trastuzumab Emtansine (μg/mL) Membrane Integrity (Cytotoxicity), EC50= 0.022 μg/mL Viability, EC50= 0.016 μg/mL Caspase 3/7 activity, EC50= 0.013 μg/mL trastuzumab emtansine によるSKBR3 細胞への細胞毒性効果のマルチプレックスアッセイ CellTox Green™ dye を用いて細胞膜の完全性（緑）を測定し、CellTiter-Fluor™ により生 細胞プロテアーゼ活性を介した細胞生存率（青）を評価しました。さらに Caspase-Glo® 3/7 試薬により、高用量でカスパーゼ活性の増加（赤）が観測され、膜の損傷および細 胞生存率の低下が認められた。 細胞状態形式検出系3D 対応測定対象製品名 細胞生存性 EP 発光〇細胞内ATP CellTiter-Glo® Assay EP 蛍光ー生プロテアーゼCellTiter-Fluor™ Assay RT 発光〇還元能RealTime-Glo™ MT ネクローシスRT 蛍光〇DNA 漏出CellTox Green™ Assay アポトーシス EP 発光〇カスパーゼCaspase-Glo® 3/7 Assay RT 発光〇ホスファチジルセリンRealTime-Glo™ Annexin V 免疫原性細胞死 RT 発光ー細胞外ATP RealTime-Glo™ Extracellular ATP Assay EP 発光〇HMGB1 Lumit® HMGB1 Immunoassay RT：リアルタイムアッセイ（経時測定が可能）。EP：エンドポイントアッセイ。 ※オリジナルのバイオアッセイの構築については弊社TRS（カスタムアッセイ開発サービス）がご利用いただけます。 11 本ガイド掲載製品に関する詳細 製品ラインナップならびに詳細情報 については以下を参照ください。 製品リスト Product List（GE921） 製品詳細資料 Biologics FlipBook （FB005） 製品使用文献 Applications for Immunotherapy Drug Development（FL652） 抗体医薬開発サポートプログラム ※ プロメガクラブへの入会（無償）が必要です。 IAP（イノベーションアクセスプログラム）： 治療用抗体の発見、免疫腫瘍学、CAR-T 細胞療法などの分野において先駆的なご研究に取り組まれている研 究者の方々とのコラボレーションを求めています。アカデミックおよび非営利団体の研究者は、このプログラ ムを通じて製薬企業が使用しているものと同じ「ゴールドスタンダード」のツールに、アカデミック専用価格で アクセスできます。バイオベンチャーの方も本IAP プログラムの対象です。 弊社 製薬& バイオテクノロジーセー ルス担当までお問合わせください（E-mail：PKKPharm@promega.com） RentaMAX：バイオアッセイに最適な 発光プレートリーダーを無償でレンタル! RentaMAX は、弊社製品をご購入いただければ、プロメガのルミノメーターを無償で一定期間お貸出しするプロ グラムです。初めてバイオアッセイを行う方にも試薬/ 機器の両面からのサポート・コンサルティングも行います。 詳しくは こちら▶ 関連製品 抗体医薬の構造解析（分離および 質量分析） プロメガは最高品質の質量分析用プロテアーゼをはじめ 抗体医薬開発に最適な抗体捕捉ビーズや抗体定量システムを提供しています。 目的製品名特長 抗体捕捉ビーズMagne® Protein A and Magne® Protein G Beads 高い特異性と結合容量を持つ磁気ビーズで、多様なサンプルから抗体を高純度・高収率で精製でき、 自動化にも対応。迅速な作業と抗体ロスの最小化を実現し、研究開発を効率化。 質量分析用 酵素ほか Trypsin Platinum, Mass Spectrometry Grade 自己分解を抑制した高純度トリプシン。高い特異性で、信頼性の高いデータを提供。 バイオ医薬品の正確な特性解析に最適。 Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade 質量分析用のタンパク質消化酵素。トリプシンとLys-C の併用により切断効率が向上し、見逃しを低減。 ペプチド同定数と定量性、再現性の向上により、高品質なデータを取得。 Rapid Digestion-Trypsin and Rapid Digestion-Trypsin/Lys C 本製品はタンパク質消化時間を最短60 分に短縮するキット。数時間かかっていた作業を大幅に短縮し、解 析のスループットを向上。簡便な操作で再現性の高いデータが得られ、研究開発を効率化。 AccuMap® Low pH Protein Digestion Kit 低pH でのタンパク質分解により、分析サンプル調製時の脱アミド化やジスルフィド結合のスクランブルなど の人為的修飾を抑制。バイオ医薬品の品質評価におけるデータの信頼性を向上。 ProteaseMAX™ Surfactant, Trypsin Enhancer タンパク質分解を促進する界面活性剤。酵素のアクセスを向上させ、1 時間で消化完了。 自己分解性なので除去不要。質量分析の感度と網羅性を高め、時間と手間を大幅に削減。 NEW Arg-C Ultra アルギニンC 末端を超特異的に切断する酵素。非特異的分解を抑制し、信頼性の高いデータを提供。 2 時間で迅速に消化、幅広いpH や尿素に対応し、解析の網羅性と効率を向上。 ProAlanase プロリン/ アラニンを特異的に切断する新規プロテアーゼで、トリプシンを補完して配列網羅性を高め、 翻訳後修飾の解析にも有用。酸性pH で活性があり、ジスルフィド結合解析にも有用。 IdeS Protease and IdeZ Protease IgG を特異的に切断する酵素で、30 分で迅速に高純度の抗体フラグメントを生成（Fc フラグメント単離）。 抗体医薬品の簡便・正確な特性解析が可能。 PNGase F （組換えグリコシダーゼ） N 型糖鎖を特異的に切断する組換え型酵素。多様な糖鎖に対応し、タンパク質の糖鎖修飾解析に有用で、 IdeS プロテアーゼとの併用で抗体品質評価の精度が向上。 IgG 抗体の高感度定量が可能なLumit® システムについては別途お問合わせください。 テクニカルサービス ● Tel. 03-3669-7980　● E-mail : prometec@jp.promega.com PK2605-01B