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免疫チェックポイントをレポーターで定量 PD-1/PD-L1

免疫チェックポイントをレポーターで定量 PD-1/PD-L1 バイオ医薬プロジェクト バイオ医薬プロジェクト第二回目は今一番ホットなターゲットの一つ、 抗 PD-1/PD-L1 抗体の新しい評価法とその他の免疫チェックポイント アッセイを取り上げます。 PD-1/PD-L1 経路はもともと正常組織を免疫反応から保護するための チェックポイントの一つであり、過剰な T 細胞活性化をコントロールす る経路です。T 細胞に発現している PD-1 と、抗原提示細胞の PD-L1 が 結合すると T 細胞は抑制され、活発な免疫反応が妨げられます。がん 細胞はこの経路を利用し、自ら PD-L1 を発現することにより T 細胞の 攻撃から逃れています。従って中和抗体などにより PD-1/PD-L1 経路を ブロックすれば、がん細胞近辺の T 細胞が活性化されてがんを攻撃・ 除去することができるのです。 このメカニズムに基づき、抗 PD-1/PD-L1 ブロック抗体はこれまで①抗 体結合アッセイ、②プライマリー T 細胞活性化アッセイ(細胞増殖、サ イトカイン放出、細胞表面マーカー検出)、などの方法で評価されてき ました。しかし①の抗体結合アッセイは機能アッセイではないという問 題があり、また②の T 細胞活性化アッセイはプライマリー T 細胞を使う ためアッセイが煩雑で結果のバラつきが大きく、スクリーニングや安定 した抗体評価に使えないという問題がありました。 この問題を克服するため、プロメガではレポーターアッセイを応用した PD-1/PD-L1 Blockade Bioassay を開発しました。PD-1/PD-L1 経路による T 細胞活性化抑制機構は、主に NFAT シグナル経路の抑制を介したメカ ニズムであることが分かっていたため、NFAT シグナル経路をレポーター 検出するアッセイを構築しました。T 細胞の代わりに NFAT レポーター と PD-1 タンパク質を発現する Jurkat 細胞を使用し、抗原提示細胞 (artificial antigen presenting cells, aAPC)として PD-L1 を発現させた CHO-K1 細胞を使用することで、プライマリー細胞を調製する煩雑さや 結果の不安定さを克服しています(図 1)。 また ADCC Reporter Bioassay 開発などで培ったノウハウをもとに細胞培 養が不要な Thaw-and-Use フォーマットを採用し、より簡便かつ安定な アッセイプロトコールにしました。これにより従来はプライマリー T 細 胞の調製から1 週間以上かかっていたアッセイを、たった 1 日半で終え ることができます(図 2)。また HTS にも適したフォーマットであるため、 抗体のほかにも PD-1/PD-L1 をブロックするペプチドや化合物のスク リーニングも容易に実施できます(図 3)。 プロメガではこの他にも T 細胞活性化をベースとした免疫チェックポ イントアッセイを多数開発しています。もう一つの PD-1 リガンドである PD-L2 のアッセイをはじめ、CTLA-4、TIGIT/CD155 などの Co-inhibitory アッセイ、GITR、CD40、4-1BB、OX40 などの Co-stimulatory アッセイが 開発済みであり、今後も新たなターゲットや既存ターゲットのコンビ ネーションアッセイを開発していく予定です。 ここでご紹介した免疫チェックポイントアッセイの他にも、プロメガで は抗体医薬品開発をサポートする画期的な製品を次々に開発していま す。次回の記事をお楽しみに! 抗体をズバッと断片化! IdeS、IdeZ 抗体の構造解析を行っている方、抗体を効率よく切断できる IdeS や IdeZ プロテアーゼはご存知ですか ? 抗体はサイズが大きいためそのままの解析が難しい反面、トリプシン などの消化に耐性があり、分析者を困らせてきました。お困りの方、ぜ ひ一度 IdeS や IdeZ をお試しください。IdeS はトリプシンやペプシンと 異なり、抗体の特定部位を高効率で切断する酵素です(図 4)。IdeZ は IdeS では切断できなかったマウス IgG2a や IgG3 も切断できる改良型で、 さらに汎用性を高めた製品です。 品質管理試験では ADCC、ADCP アッセイで測定できる抗体力価と並ん で、抗体の物性解析も重要です。IdeS、IdeZ で物性解析もワンランクアッ プさせましょう。 関連製品 サイズ カタログ番号 価格(¥) 免疫チェックポイントアッセイ PD-1/PD-L1 Blockade Bioassay 1 kit J1250 151,000 特 5 kit J1255 680,000 サイズ カタログ番号 価格(¥) IdeZ Protease, Frozen 2000 u V8342 86,000 特 IdeS Protease, Frozen 2000 u V7512 81,000 特 キャンペーン対象製品:詳細については 8 ページをご覧ください。 抗体医薬に代表されるバイオ医薬品の研究開発が加速しています。このセクションでは、抗体医薬の研究・評価試験のうち従来法の問題を新たな技 術で克服したアッセイや、従来法では対応できなかった新しいニーズに応えるアッセイをシリーズでご紹介していきます。 プロメガ PD-1/PD-L1 検索 図 2. 従来 1-2 週間かかっていたプロトコールが大幅に簡便化され、早ければ 1 日で結果 が出る 12052MA 約1~2週間(従来法) 調達した細胞 培養 細胞数カウント、回収、 バッファーに懸濁、プレートに播種 測定 キットに添付の細胞 (解凍してそのまま使用) ‘Cells as reagents’: Frozen, thaw-and-use cells (3-24hr) バッファーに懸濁、 プレートに播種 測定 24時間以内(PD-1/PD-L1 Blockade Bioassay) 図 1. 免疫チェックポイント遮断アッセイの概要 13008MA イベント 1 TCR(T 細胞受容体)を介した NFAT の活性化 イベント 3 抗PD-1 または 抗PD-L1 抗体による NFAT シグナルの回復 イベント 2 PD-1:PD-L1 による NFAT シグナル の阻害 PD-1 Effector Cell PD-L1 aAPC Cell Glo NFAT-RE Luciferase Signal Recovery PD-1 PD-L1 図 4. IdeS、IdeZ は IgG ヒンジ領 域の下を一か所切断して F(ab’)2 と Fc 断片を生じる IdeS or IdeZ cleavage site IdeS or IdeZ lgG1 Hinge Sequence: S-C-D-K-T-H-T-C-P-P-C-P-A-P-E-L-L-G-G-P-S-V 図 3. 抗 PD-1 抗体医薬品での力価測定 PD-L1 aAPC/CHO-K1 細胞を播種し、16-20 時間インキュベーションした。PD-1 エフェクター 細胞とペンブロリズマブ(パネル A)またはニボルマブ(パネル B)の濃度を変えて添加し、 37℃で 6 時間インキュベーションした後、Bio-Glo™ Reagent を加え、GloMax® Discover System を用いて測光した。データは GraphPad Prism® Software を用いて4PL curve にフィッ ティングさせた。EC50 値はそれぞれ 0.25 µg/ml(ペンブロリズマブ ; パネル A)および 0.44 µg/ml (ニボルマブ ; パネル B)。データは thaw-and-use の細胞を用いて取得した。 Log10 [pembrolizumab] g/ml Luminescence (RLU) 0 5.0 × 105 1.5 × 106 1.0 × 106 2.0 × 106 2.5 × 106 –9 –8 –7 –6 –5 –4 A. 13490MA Log10 [nivolumab] g/ml Luminescence (RLU) 0 5.0 × 105 1.5 × 106 2.0 × 106 –9 –8 –7 –6 –5 –4 1.0 × 106 2.5 × 106 B. 2