【細胞用】ReliaPrep™ RNA Miniprep System 簡易日本語プロトコル

ReliaPrep™ RNA Miniprep System INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCTS Z6014, Z6015 Quick PROTOCOL Revised 2026/05 詳細なプロトコールは、英文マニュアル #TM774 をご覧ください。 【細胞用プロトコール】 キット構成品のうち1-Thioglycerolは開封後2～10℃、その他は15~30℃で保管してください。 RNA精製を行う際には、手袋やマスクを着用するなど、RNaseの混入を避けるように注意してください。 試薬の調製 ◎RNA Wash Solution(RWA)、Column Wash Solution(CWE)の調製 RWAおよびCWEのボトルに95%エタノールを下表のとおり、添加します。 ＊添加後は蓋をしっかりと締めて、15～30℃で保管してください。 ◎BL+TG Bufferの調製 BL Bufferのボトルに1-Thioglycerol(TG)を下表のとおり、添加します。 ＊添加後は蓋をしっかりと締めて保管してください。2～10℃で、調製後30日間保管が可能です。 ＊使用計画に応じて、使い切れる量を調製してください。 ◎DNase Iの調製 DNase I(凍結乾燥) のチューブ1本あたり275μlのNuclease-Free Water(キット付属) を加えて穏やかに撹拌し溶解します。溶解する際に、ボルテックスはしないでください。 ＊溶解したDNase I溶液は、使用量に応じて分注して、-20℃で保管してください。3回を超える凍結融解は避けてください。 プロトコールの概要 試薬 RNA Wash Solution Column Wash Solution Z6014 Z6015 Z6014 Z6015 構成品ボトル 35ml 206ml 5ml 24ml 95%エタノール 60ml 350ml 7.5ml 36ml 試薬 BL Buffer Z6014 Z6015 BL Buffer 32.5ml 150ml 1-Thioglycerol 325μl 1500μl ReliaPrep™ RNA Miniprep System INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCTS Z6014, Z6015 Quick PROTOCOL 技術的なお問合せは： e-mail: prometec@jp.promega.com・Tel: 03-3669-7980 詳細なプロトコールは、英文マニュアル #TM774 をご覧ください。 Revised 2026/05 細胞の準備 ＜浮遊細胞の場合＞ 1. 300 x gで5分間遠心して、細胞を回収します。沈殿した細胞ペレットに、滅菌済みの冷却した1xPBSを加えて洗浄します。300 x gで再度5分間遠心して、上清を丁寧に除きます。 2. BL Bufferに1-Thioglycerol(TG)を添加したことを確認し、下表にしたがってBL+TG Bufferを加えます。 3. ゲノムDNAのせん断のため、P200またはP1000で7-10回のピペッティングを行います。 注意：細胞数が2×106個よりも多い場合には、ライセートを20Gの針で4～5回通してください。 ＜接着細胞の場合＞ 1. 培地を除き、下表の通りに滅菌済みの冷却した1xPBSを加えて洗浄します。PBSを丁寧に除きます。 2. BL Bufferに1-Thioglycerol(TG)を添加したことを確認し、下表にしたがってBL+TG Bufferを加えます。 3. ゲノムDNAのせん断のため、P200またはP1000で7-10回のピペッティングを行います。その後、ライセートを回収し、新しいチューブに移します。作製したライセートは、-70℃で保存することが可能です。 注意：細胞数が2×106個よりも多い場合には、ライセートを20Gの針で4～5回通してください。 細胞数 BL + TG Buffer添加量 1 x 102 ~ 5 x 105 100μl >5 x 105 ~ 2 x 106 250μl >2 x 106 ~ 5 x 106 500μl プレートの種類 1xPBS添加量 96-well 100μl 48-well 250μl 24-well 500μl 6-well 2000μl T-25 flask 5000μl プレートの種類 BL + TG Buffer添加量 96-well 100μl 48-well 100μl 24-well 100μl 6-well 250μl T-25 flask 500μl ReliaPrep™ RNA Miniprep System INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCTS Z6014, Z6015 Quick PROTOCOL 技術的なお問合せは： e-mail: prometec@jp.promega.com・Tel: 03-3669-7980 詳細なプロトコールは、英文マニュアル #TM774 をご覧ください。 Revised 2026/05 細胞からのRNA精製プロトコール 1. 下表にしたがって、サンプルに100%イソプロパノールを添加し、5秒間ボルテックスします。 注意：凍結保存したライセートを使用する場合には、氷上または2～10℃で融解し、十分に混和して均一化してからご使用ください。 2. ミニカラムをCollection Tubeにセットし、サンプルを加えて室温(20～25℃)で遠心します(12,000～14,000 x g, 30秒間)。 3. Collection Tubeに貯まった液(フロースルー)を捨て、再度ミニカラムをCollection Tubeにセットします。500μlのRNA Wash Solution(エタノール添加済み)をミニカラムに加えて遠心します(12,000～14,000 x g, 30秒間)。フロースルーを廃棄します。 4. DNase I Incubation mixを調製します。ボルテックスを避けて穏やかに混合してください。下表には1サンプルあたりの試薬量を示しています。サンプル数に応じて試薬量を計算して、混合・調製してください。 5. 30μl のDNase I Incubation mixをミニカラムに添加して、室温で15分間インキュベートします。 6. 200μlのColumn Wash Solution(エタノール添加済み)をミニカラムに加えて遠心します(12,000～14,000 x g, 15秒間)。 7. 500μlのRNA Wash Solution(エタノール添加済み)をミニカラムに加えて遠心します(12,000～14,000 x g, 30秒間)。 8. ミニカラムを新しいCollection Tubeに移し替えて、300μlのRNA Wash Solution(エタノール添加済み)を加えて遠心します (12,000～14,000 x g, 2分間)。 9. ミニカラムをElution Tubeに移し替えます。下表を参考にして、溶出用のNuclease-Free Waterをミニカラムに加えて、遠心します(12,000～14,000 x g, 1分間)。Elution Tubeは蓋同士が当たらないように蓋を外側に向けます。 10.チューブのキャップを閉めて、-70℃で精製RNAを保管します。 細胞数 100%イソプロパノール添加量 1 x 102 ~ 5 x 105 35μl >5 x 105 ~ 2 x 106 85μl >2 x 106 ~ 5 x 106 170μl 試薬 Volume ｘ サンプル数 ＝ 合計 Yellow Core Buffer 24μl MnCl2, 0.09M 3μl DNase I 3μl 組織重量 Nuclease-Free Water添加量 1 x 102 ~ 5 x 105 15μl >5 x 105 ~ 2 x 106 30μl >2 x 106 ~ 5 x 106 50μl