ヒトの骨からのDNA抽出

関西医科大学法医学講座橋谷田真樹先生のご協力のもと作成した、人骨からのDNA抽出を核酸自動精製装置Maxwell® RSCを用いて行うプロトコルです。ゲノムDNA ヒトの骨からのDNA抽出骨（ヒト）抽出物DNA サンプル種ヒトの骨（第二次世界大戦頃のもの）生物種ヒトサンプル量100 mg（粉末）使用キット Bone DNA Extraction Kit (Cat.#DC6051), Maxwell® FSC DNA IQ™ Casework Kit (Cat.# AS1550) 解析ー用意するもの • 歯科用ドリル • マルチビーズショッカー（安井器械） • Bone DNA Extraction Kit (Cat.# DC6051) • Maxwell® RSC Instrument (Cat.# AS4500) • Maxwell® FSC DNA IQ™ Casework Kit (Cat.# AS1550) • ボルテックスミキサー • 1.5 ml 遠心チューブ • 56℃に設定されたヒートブロックシェーカー • 高速遠心機【脱灰処理】 1. 骨を洗剤で洗浄した後、歯科用ドリル（A）で2 cm 程度の大きさに切断する（B）。 2. 骨片をマルチビーズショッカーで粉末化する（C）。 3. 粉末100 mg を1.5 ml 遠心チューブに移す。 1. 下記に従い、検体数+2 本分の骨溶解カクテルA を調製する。試薬1 検体分の量 Demineralization Buffer 400 μl Proteinase K (PK) Solution 40 μl 1-Thioglycerol 10 μl 2. 骨溶解カクテルA を骨粉の入った遠心チューブに400 μl ずつ加え、ボルテックスで10 秒間で攪拌する。 3. ヒートブロックシェーカーで2.5 時間、56℃で加熱しながら1000 rpm で振盪する（D）。 A C D 本プロトコルは関西医科大学法医学講座橋谷田真樹先生のご協力のもと作成したものです。 B プロトコール【検体の前処理】お問合せ：プロメガテクニカルサービス　● Tel. 03-3669-7980 / Fax. 03-3669-7982　● E-mail: prometec@jp.promega.com プロメガ日本語ウェブサイト　www.promega.jp 1 ゲノムDNA 骨（ヒト）ヒトの骨からのDNA 抽出（続き） 4. 検体をヒートブロックシェーカーから取り出しボルテックスで10 秒攪拌する。 5. 13,000 x g で5 分間遠心した後に上清を新しいチューブに移す。骨粉のペレットは廃棄してよい。 6. 下記に従い、検体数+2 本分の骨溶解カクテルB を調製する。試薬1 検体分の量 Lysis Buffer 990 μl 1-Thioglycerol 10 μl 7. 骨溶解カクテルB を上清の入った遠心チューブに800 μl ずつ加え、ボルテックスで10 秒間攪拌する。【カートリッジの準備～ラン】 1. 検体数分のカートリッジをMaxwell® RSC/CSC Deck Tray に立て、順にアルミシールを剥がす（E, F）。 ※ カートリッジの両端がカチッというまで、しっかりとセットする。 2. 同数のElution Tube をセットし、50 μl のNuclease-Free Water を加える。（G, H）。 ※ Elution Tube は下までグッと強く押し込んでください。 ※ Elution Tube のフタは、図のように手間側に向けてください。 ※ Elution Tube のフタは絶対に閉めないでください。 Nuclease-Free Water E G F H お問合せ：プロメガテクニカルサービス　● Tel. 03-3669-7980 / Fax. 03-3669-7982　● E-mail: prometec@jp.promega.com プロメガ日本語ウェブサイト　www.promega.jp 2 ゲノムDNA ヒトの骨からのDNA 抽出（続き） 3. カートリッジのウエル8 に、プランジャーを置く（I, J）。 4. インキュベーション後のサンプルを全量( 約1.1 ml) をカートリッジのウエル#1 に加え、3-4 回のピペッティングを行い、十分に撹拌する。（K）。 5. Maxwell® RSC にMaxwell® RSC/CSC Deck Tray をセットし、自動精製のランを開始する（L）。 K I J L 骨（ヒト）結論従来はEDTA を用いる脱灰処理に2 日、スピンカラムでのDNA 精製に半日程度の処理時間を要していたが、Bone DNA Extraction Kit とMaxwell® RSC を組み合わせることで脱灰処理を2.5 時間、DNA 精製を30 分に短縮でき、STR 解析が可能なレベルのDNA をその日のうちに得ることができた。精製後のDNA を用いた定量ならびにSTR 解析の結果は従来法を用いた場合と同等であり、時短化に非常に有効であった。また、汎用機器であるヒートブロックシェーカーと遠心機があれば処理でき、特別な機器を必要としないためコスト面での負担もなかった。お問合せ：プロメガテクニカルサービス　● Tel. 03-3669-7980 / Fax. 03-3669-7982　● E-mail: prometec@jp.promega.com プロメガ日本語ウェブサイト　www.promega.jp 3