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Flexi vectors 簡易プロトコール

Flexi® Vector Systems INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCTS C8640, C8820, C9320 Quick PR OTO COL 技術的なお問合せは: e-mail: prometec@jp.promega.com・Tel: 03-3669-7980・Fax: 03-3669-7982 詳細なプロトコールは、英文マニュアル #TM254 をご覧ください。 Revised 2012/04 Flexi® Vector System は低頻度出現の制限酵素(レアカッター)Sgf I および Pme I による切断をベースにしており、迅速で効率よく目的遺伝 子をクローニングあるいは移し換えることができます。 Flexi® Vector に含まれるバーナーゼ致死遺伝子が目的の DNA 断片 と置換されることによるポジティブセレクションを行うことで、得られたコロ ニーは、非常に高い効率で目的遺伝子を含みます(プロトコル 1)。 ま た、一度 Flexi® Vector に組み込んだ目的遺伝子は、Sgf I および Pme I で切断することで簡単に別の Flexi® Vector へ相互に組み換え ることが可能です(プロトコル 2)。 プロトコル1:Flexi ベクターへの cDNA の組み込み 1) 以下のようなプライマーを設計して、PfuDNA Polymerase (カタログ番号 M7741)など正確性の高い PCR 酵素を使い、目 的のタンパク質のコード領域(cDNA)を増幅します。プライマーの 設計は、以下のサイトでも可能です。 (Flexi® Vector Primer Design Tool http://www.promega.com/techserv/tools/FlexiVectorTool/) 2) Wizard® SV Gel and PCR(カタログ番号A9281)をお使いい ただき、PCR 産物を精製します。 3) 精製した PCR 産物、ベクターを制限酵素処理します。 Component① Volume 5× Flexi® Digest Buffer 4l 精製した PCR 産物 (最大 500ng) -l Flexi® Enzyme Blend (SgfI&PmeI) 4l Nuclease-Free Water で fill-up 20l Component② Volume Nuclease-Free Water 12l 5× Flexi® Digest Buffer 4l 組み込み先の Flexi®ベクター(200ng) 2l Flexi® Enzyme Blend (SgfI&PmeI) 2l Final Volume 20l 37℃、30 分の反応の後、ベクター②は、65℃、20 分加熱します。 PCR 産物①は加熱せずに、次のステップへ進みます。 4) PCR 産物①は、制限酵素等を取り除くため、Wizard® SV Gel and PCR(カタログ番号 A9281)をお使いいただき、プロトコ ールに従って精製します。 5) ライゲーション反応を行います。 Component Volume 2× Flexi® Ligase Buffer 10l 制限酵素処理したベクター(50ng) 5l 制限酵素処理後に精製した PCR 産物(100ng) -l T4 DNA Ligase (HC) (20u/l) 1l Nuclease-Free Water で fill-up 20l 室温で 1 時間反応します。 注) 2xFlexi® Ligase Buffer は ATP を含んでおり、凍結融解を繰り返さないように してください。必要に応じて分注保存をしてください。 6) ラ イ ゲ ー シ ョ ン し た 産 物 を 、 高 い 導 入 効 率 (>1x108cfu/gDNA) を持つコンピテントセル(カタログ番号 L2001 など)へ形質転換します(詳細はマニュアル9.G.を参照)。 2lを利用します。 7) 8-12 コロニーをチェックする。GoTaq® Green Master Mix は、 コロニーPCR に最適です。 GoTaq® Green Master Mix を使ったコロニーPCR 法と 制限酵素処理の組み合わせによる簡易インサート確認法 https://www.promega.co.jp/lit/pdf/GoTaq_Green_Master_Mix .pdf 8)大腸菌でプラスミドを増幅し、精製。シークエンスを確認する。 シーケンスプライマーの情報は、Flexi ベクターの種類に合わせ て以下のページよりご確認ください。 Sequencing Primers for Flexi® Vector Inserts (https://www.promega.jp/resources/pubhub/enotes/sequenci ng-primers-for-flexi-vector-inserts/) Flexi® Vector Systems INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCTS C8640, C8820, C9320 Quick PR OTO COL 技術的なお問合せは: e-mail: prometec@jp.promega.com・Tel: 03-3669-7980・Fax: 03-3669-7982 詳細なプロトコールは、英文マニュアル #TM254 をご覧ください。 Revised 2012/04 プロトコル 2A:Protein-Coding Region の移し替え 同じ制限酵素サイトを使う場合 (たとえば pFN21A から pFN29K へ) 1) Wizard® Plus SV Minipreps などのキットで精製したプラスミ ド(Donor)と、遺伝子を移す先のベクター(Acceptor)を、制限酵 素で処理します。Acceptot Vector は、致死遺伝子が組み込ま れているため、大腸菌で増幅して使用することはできない。購入 したものを用いてください。 2) 表に従って、試薬とプラスミドを混ぜて反応します。 Component Volume 5× Flexi® Digest Buffer 4l Acceptor Flexi® Vector (100ng) 1l Donor Flexi® Vector (100ng) -l Flexi® Enzyme Blend (SgfI&PmeI) 2l Nuclease-Free Water で fill-up 20l 3) 37℃、15-30 分間 反応する。 4) 制限酵素を失活させるため 65℃、20 分間熱処理を行う。 ステップ 5 まで、反応液は氷上で保存する。 5) 制限酵素処理したプラスミドにバッファー、酵素を加えてライ ゲーションする。 Component Volume 2X Flexi® Ligase Buffer 10l 制限酵素処理済みの DNA (合計 100ng) 10l T4 DNA Ligase (HC) 1l Final Volume 21l 6) 室温で 1 時間反応します。 注) 2xFlexi® Ligase Buffer は ATP を含んでおり、凍結融解を繰り返さないように してください。必要に応じて分注保存をしてください。 7) ラ イ ゲ ー シ ョ ン し た 産 物 を 、 高 い 導 入 効 率 (>1x108cfu/gDNA) を持つコンピテントセル(カタログ番号 L2001 など)へ形質転換します(詳細はマニュアル 9.G.を参 照)。 8) 少なくとも 4 コロニーをチェックする。GoTaq® Green Master Mix は、コロニーPCR に最適です。 GoTaq® Green Master Mix を使ったコロニーPCR 法と 制限酵素処理の組み合わせによる簡易インサート確認法 https://www.promega.co.jp/lit/pdf/GoTaq_Green_Master_Mix .pdf 9)大腸菌でプラスミドを増幅し、精製。シークエンスを確認する。 シーケンスプライマーの情報は、Flexi ベクターの種類に合わせ て以下のページよりご確認ください。 Sequencing Primers for Flexi® Vector Inserts (https://www.promega.jp/resources/pubhub/enotes/sequenci ng-primers-for-flexi-vector-inserts/) Flexi® Vector Systems INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCTS C8640, C8820, C9320 Quick PR OTO COL 技術的なお問合せは: e-mail: prometec@jp.promega.com・Tel: 03-3669-7980・Fax: 03-3669-7982 詳細なプロトコールは、英文マニュアル #TM254 をご覧ください。 Revised 2012/04 プロトコル 2B:Protein-Coding Region の移し替え N 末タグベクターから、C 末タグベクターへの移し替えの場合 (たとえば pFN21A から pFC18K へ) 1) ドナーとなるプラスミドを Wizard® Plus SV Minipreps System(#A1300)などを用いて準備する。 2) ドナーとなるプラスミドを制限酵素処理する。 Component Volume 5× Flexi® Digest Buffer 2l Donor Flexi® Vector (100ng) -l Flexi® Enzyme Blend (SgfI&PmeI) 1l Nuclease-Free Water で fill-up 10l 3) 移し替える先(Acceptor)となるプラスミドを制限酵素処理す る。 Component Volume 5× Flexi® Digest Buffer 2l Acceptor C-terminal Flexi® Vector (100ng) 1l Carboxy Flexi® Enzyme Blend (SgfI&EcoICRI) 1l Nuclease-Free Water 6l Final volume 10l 4) 37℃で 15-30 分間 インキュベーションする。 5) 65℃で 20 分間インキュベーションし、制限酵素を不活性化 する。ライゲーション反応するまで氷上で保管する。 6) 室温で 1 時間反応します。 注) 2xFlexi® Ligase Buffer は ATP を含んでおり、凍結融解を繰り返さないように してください。必要に応じて分注保存をしてください。 Component Volume 2X Flexi® Ligase Buffer 10l 制限酵素処理済みの donor DNA (合計 50ng) 5l 制限酵素処理済みの acceptor DNA (合計 50ng) 5l T4 DNA Ligase (HC) 1l Final Volume 21l 7) ラ イ ゲ ー シ ョ ン し た 産 物 を 、 高 い 導 入 効 率 (>1x108cfu/gDNA) を持つコンピテントセル(カタログ番号 L2001 など)へ形質転換します(詳細はマニュアル 9.G.を参 照)。 8) 少なくとも 8 コロニーをチェックする。GoTaq® Green Master Mix は、コロニーPCR に最適です。 GoTaq® Green Master Mix を使ったコロニーPCR 法と 制限酵素処理の組み合わせによる簡易インサート確認法 https://www.promega.co.jp/lit/pdf/GoTaq_Green_Master_Mix .pdf 9)大腸菌でプラスミドを増幅し、精製。シークエンスを確認する。 シーケンスプライマーの情報は、Flexi ベクターの種類に合わせ て以下のページよりご確認ください。 Sequencing Primers for Flexi® Vector Inserts (https://www.promega.jp/resources/pubhub/enotes/sequenci ng-primers-for-flexi-vector-inserts/)