GoTaq® 1-Step RT-qPCR System

GoTaq® 1-Step RT-qPCR System INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCTS A6020 Quick PR OTO COL 技術的なお問合せは： e-mail: prometec@jp.promega.com・Tel: 03-3669-7980・Fax: 03-3669-7982 詳細なプロトコールは、英文マニュアル #TM355 をご覧ください。 Revised 2012/04 プロトコール概要 プロトコール 1. リアルタイム機器のプログラム、フィルターを設定します。 2. GoTaq® 1-Step RT-qPCR Systemの構成物を溶解し、 RNAと、プライマーを用意します。それぞれ溶解した後、軽く ボルテックスを行い、混ぜておきます。 3. 準備： a. RNAサンプル（Total RNA、mRNA, viral RNAなど [500fg-100ng]）を水もしくは、qPCRに影響を与え たない希釈液で溶解します。 b. コントロール、定量スタンダードを用意します。 c. プライマー濃度：１Xの濃度はおよそ50-300nMで反 応します。 4. 表にしたがって、構成物を氷上の滅菌済みチューブで用意し て、プレートに分注します。プレートに分注後、低速で 1 分間 遠心します。 5. プレートを機器にセットして、スタートします。 6. 反応終了後に解析を行います。 プログラムの設定（標準法と Fast 法） ステージ サイクル 数 標準または Fast モード 1.逆転写 1 ≥37°C、15 分 2.RT 不活性化/ホ ットスタート活性化 1 95°C、10 分 3.3-ステップ qPCR 40 a.変性 95℃、10 秒 ｂ.アニーリング/デー タ収集 60℃、30 秒 ｃ.伸長 72℃、30 秒 4.解離 1 60-95℃ 機器のフィルター設定 検出フィルター： FAMTM, SYBR®（BRYT®） リファレンス波長： ROXTM（CXR） GoTaq® 1-Step RT-qPCR 反応の調製 構成成分 容量 （20μl あ たり） 容量 （50μlあ たり） 終濃度 GoTaq® qPCR Master Mix, 2X 10μl 25μl 1X Forward Primer, 10X 2μl 5μl 50–300nM Reverse Primer, 10X 2μl 5μl 50–300nM GoScript™ RT Mix for 1-Step RT-qPCR, 50X Nuclease-Free Water for Minus-RT Control 0.4μl 1.0μl 1X RNA Template (500fg– 100ng) Nuclease-Free Water for No-Template Control 4μl 10μl variable オプション: MgCl2, 25mM* __μl __μl ≥2mM オプション: CXR Reference Dye, 30μM** __μl __μl ≥33nM Nuclease-Free Water to 20μl to 50μl — 注1：CXRの添加が必要な機器を利用する場合、100×CXR reference dye を あらかじめ2×GoTaq® qPCR Master Mixに1mlに対して100×CXR reference dye 20μl を先に加えてください。その後、1 サンプルあたり25.5μl 分注するなどの方 法で行ってくだい。 注２:MgCl2 を追加しない場合の最終濃度は 2mM です。 CXR リファレンスダイの添加が不要な機種 Applied Biosystems 7500＆7500 Fast Real Time PCR Systems Stratagene Mx3000P® and Mx3005P® Quantitative PCR Systems Roche LightCycler® 480 Roche LightCycler 1.5 and 2.0 systems BioRad Chromo4™ Real-Time Detector BioRad CFX Real-Time PCR Detection Systems BioRad iCycler iQ5™ and MyCycler™ Eppendorf Mastercycler® ep realplex4 and realplex4 S Qiagen Rotor-Gene ™ Q, 3000, and 6000 CXR リファレンスダイの添加が必要な機種（終濃度 1X） Applied Biosystems 7000 Sequence Detection System Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System Applied Biosystems 7700 Sequence Detection System Applied Biosystems 7900HT Real-Time PCR System Applied Biosystems StepOne® and StepOne®Plus Real-Time PCR Systems RNA サンプルを用意し、プ ライマー＋GoTaq® 1-Step RT-qPCR ミック スを混ぜる プレートに分注する 増幅曲線、アニーリング 解析、標準サンプルの検 量線を作成し、解析を行 う。 標準方法もしくは Fast モードで、RT-qPCR 反 応を行う。