Maxwell® RSC simplyRNA Tissue Kit （３次元培養ヒト皮膚モデル用）

Maxwell® RSC simplyRNA Tissue Kit (カタログ番号 AS1340) 簡易マニュアル 3次元培養ヒト皮膚モデルからのRNA精製 注意：キットを受け取りましたら、1-Thioglycerolを取り出し、キット箱は室温で保存してください。 取り出した1-Thioglycerolは2～10℃で保存してください。 ご用意いただくもの • ボルテックスミキサーまたはチューブミキサー • マイクロピペット (～20μl、～200μl、～1000μl)とそれらのチップ • アイスブロックまたは氷箱 試薬の準備 １－Thioglycerol/Homogenization Solutionの調製 1. 1mlのHomogenization Solutionあたり20μlの1-Thioglycerolを添加する。 RNA精製の工程において、1サンプルあたり、200μlの1-Thioglycerol/Homogenization Solutionを使用します。 1-Thioglycerolは還元剤であり、2-MEの代わりに利用します。1-thioglycerolは毒物には該当しません。 2. 1-Thioglycerol/Homogenization Solutionは使用するまで氷上にて冷やしておく。 1-Thioglycerol/ Homogenization Solutionは2-10℃で保存してください。30日まで安定です。 DNase I 1. 凍結乾燥品のDNase Iのバイアルに、275μlのNuclease-Free Waterを添加する。 蓋をしてバイアルをおだやかに転倒混和し、内側に付着している粉体もリンスする。 DNaseは物理衝撃に弱いため、ボルテックスは避けてください。 2. 試薬の視認性を上げるため、5μlのBlue Dyeを添加する。 3. 使用後のDNase I溶液は、1回の実験で使用する分量に分注し、-20℃で保存する。 10回までの凍結融解において、活性を維持できます。 Ver. 1.0 (2025年12月作成) pg. 2 技術的なお問合せは： e-mail: prometec@jp.promega.com・Tel: 03-3669-7980・Fax: 03-3669-7982 サンプルの前処理 1. 必要本数分の1.5mLチューブに1-Thioglycerol/Homogenization Solutionを200μlずつ分注し、氷上で冷却しておく。 RNaseの酵素活性を抑えるため、良く冷やしておきます。 2. ヒト皮膚モデルをピンセットで剥がし、1のチューブに入れ、氷上で冷却を維持する。 1プレート分を目安に、本作業を行います。 3. 皮膚モデルが破砕（断片化）されるまで、5～10分間ボルテックスする。 長めのミキシングのため、ボルテックスアダプターやチューブミキサーの利用が便利です。 この段階では、完全に見えなくなるまでは破砕されませんが、モデルが破れてしっかり断片化すれば十分です。 ＊その日に精製を行わない場合は、ここで冷凍保存(-80℃を推奨)が可能です。 冷凍した場合は、氷上(2-10℃)で融解してから次のステップに進みます。 4. 200μlのLysis Bufferを添加し、皮膚モデル断片が見えなくなるまで1～２分間ボルテックスする。 このステップでしっかり混合することで、断片が見えなくなり、クリアなLysateになります。 効率的な精製、残存断片によるチップ詰まり防止のため、完全に溶解したことを確認してください。 Lysis Bufferを加えた後は、析出を避けるため、冷やさないでください。 5. 3ページ目の『カートリッジの準備』に進む。 ＊本プロトコルは、株式会社ジャパン・ティッシュエンジニアリング(J-TEC)製 LabCyte EPI-MODEL24に最適化しています。それ以外のメーカーの皮膚モデルでは、ボルテックス条件等が変わる可能性がございますので、予備検討を行うことをお勧めいたします。 pg. 3 技術的なお問合せは： e-mail: prometec@jp.promega.com・Tel: 03-3669-7980・Fax: 03-3669-7982 カートリッジの準備 1. サンプル数分のカートリッジをMaxwell® RSC/CSC Deck Trayにセットし、アルミシールを剥がす。 カートリッジの両端がカチッというまで、しっかりとはめ込む。 サンプル数が少ない場合には、できるだけMaxwell® RSC/CSC Deck Trayの中央付近をお使いください。 2. 同数のElution Tubeをセットし、50μlのNuclease-Free Waterを入れる。 Nuclease-Free Waterは30～100μlの範囲で入れることができます。ただし、30μlにした場合、溶出液中に磁性ビーズが残存しやすくなるため、標準として50μl Nuclease-Free Waterでの溶出をお勧めします。 注意：Elution Tubeのフタは絶対に閉めないでください。 3. カートリッジのウェル8に、プランジャーを置く。 ウェル8は一番手前の形状が異なるウェルです。 4. 10μl のDNase I 溶液をカートリッジのウェル4に添加する。 ウェル4は、黄色い試薬の入ったウェルです。 DNase I溶液は、粘性があり壁面から自然落下しないため、ウェル4内の液に直接加えてください。 5. 全量のライセート (約400μl)をカートリッジのウェル1に添加する。 ウェル1は最も大きなウェルです。カートリッジラベルに一番近く、Elution tubeからは最も遠い位置にあります。 6. Maxwell RSC Instrumentを起動し、Startから、『simplyRNA Tissue／AS1340』を選択する。 7. Maxwell® RSC/CSC Deck Trayを、Maxwell® RSC本体にセットしする。 8. セッティングの最終確認後、精製操作をスタートする。 ☐ プランジャーがセットされている ☐ Elution Tubeが浮かずにセットされている ☐ Elution TubeにNuclease Free Waterが入っている 精製終了後の操作 1. Maxwell RSC® Instrumentのドアを開け、Elution Tubeのフタを閉める。 2. Maxwell® RSC/CSC Deck Trayを取り出し、Elution Tubeを適切に保管する。 磁性体ビーズの混入がみられた場合、14,000xgで２分間の遠心操作により除くことができます。 3. Maxwell RSC® Instrumentのドアを閉める。カートリッジとプランジャーを廃棄する。