質量分析のための試薬ガイド

質量分析グレードの各種プロテアーゼやLC-MS 性能評価用試薬、グリコシダーゼなどを網羅

質量分析のための試薬ガイド トリプシンとトリプシン消化キット その他プロテアーゼと消化促進剤 Arg-C Ultra、 ProAlanase rChymoSelect™ サンプル調整 ・ リファレンス試薬 Magnetic Proteomics Sample Prep Kit グリコシダーゼ 2トリプシンは、 質量分析用サンプル前処理において最も広く使用されているプロテアーゼです。 リジンおよびアルギニン残基 のカルボキシ末端側を切断する、 高い特異性を有するセリンプロテアーゼです。 トリプシンによるタンパク質消化では、 質量 分析に最適なサイズ （7 ～ 20 アミノ酸、 0.5 ～ 3 kDa） のペプチドが生成されます。 トリプシン消化ペプチドは C 末端に強 い電荷を持つため、 効率的にイオン化されます。 トリプシンは、 ゲル内消化、 溶液内消化、 オンビーズ消化など、 さまざまな消化手法に使用されます。 消化後に得られたペ プチドはペプチドマスフィンガープリンティングまたはタンデム質量分析 （MS/MS）により同定されます。 この手法はボトムアッ ププロテオミクスと呼ばれ、 タンパク質の検出および特性解析を行います。 トリプシンの厳密な切断特異性は、 質量分析によるタンパク質解析に不可欠です。 プロメガの高品質トリプシンは、 最大限の プロテアーゼ活性と切断特異性を実現するように修飾されています。 Trypsin Gold Trypsin Platinum Trypsin/Lys-C Rapid Trypsin AccuMAP® 消化効率 ★ ★ ★★★ ★ ★ 切断特異性 ★ ★★★ ★ ★ ★ スピード消化 ★ ★ ★ ★★★ ★ 人為的修飾の無い サンプル調製 ★ ★ ★ ★ ★★★ 自己消化耐性 ★ ★★★ ★ ★ ★ 主な用途 • 一般的なプロテオミ クス • ゲル内消化 • ペプチドマッピン グ • 最も高い特異性 • 困難なタンパク質 • 定量解析 • 迅速な結果取得 • ハイスループット / 自動化 • ペプチドマッピング • アーティファクト 低減 トリプシン製品特長比較 製品名 切断部位 特長 容量 カタログ番号 トリプシン （酵素） Trypsin Platinum, Mass Spectrometry Grade Lys-C、 Arg-C 特異性と自己消化耐性が極めて高い。 リコンビナントであり、 動物由来タンパク質の混入がない。 100 µg VA9000 Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade トリプシンと Lys-C の両方の作用で切れ残りを低減し、 サンプ ル間の再現性が向上。 20 µg V5071 100 µg V5072 5 x 20 µg V5073 Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade 質量分析グレード。 特異性が向上し （TPCK 処理）、 自己消 化を予防 （リジンの還元メチル化）。 100 µg V5280 Sequencing Grade Modified Trypsin シークエンシンググレード。 特異性が向上し （TPCK 処理）、 自己消化を予防 ( リジンの還元メチル化 )。 V5111、 V5117 は凍結乾燥粉末、 V5113 は凍結溶液 （0.5 mg/ml : in 50 mM acetic acid） 5 x 20 µg V5111 5 x 20 µg V5113 100 µg V5117 トリプシン （キット） Rapid Digestion Kit –Trypsin Lys-C、 Arg-C 70℃で処理することでトリプシン消化が 60 分で完了。 ヒート ブロックがあれば実施でき、 多検体分析にも◎ 100 µg （100 回反応分） VA1060 Rapid Digestion Kit –Trypsin/Lys-C 70℃で処理することでトリプシン /Lys-C 消化が 60 分で完了。 ヒートブロックがあれば実施でき、 多検体分析にも◎ 100 µg （100 回反応分） VA1061 AccuMAP® Low pH Protein Digestion Kit 低 pH でサンプル調製を行うことにより、 人為的な非酵素的 修飾を抑制。 還元 ・ 非還元どちらの条件下でも、 変性剤存 在下でも使用可能。 サンプル調製は 4.5-5 時間で完了。 10 回反応分 * VA1040 100 回反応分 ** VA1050 自己消化耐性 消化効率 特異性 *500 µg のタンパク質を消化するのに十分な試薬が含まれます。 **5 mg のタンパク質を消化するのに十分な試薬が含まれます。 トリプシンとトリプシン消化キット トリプシンとトリプシン消化キット 3 ページ 3 ページ 4 ページ 4 ページ 4 ページ 3 ∱⓮⦕಍⑇፥ಊಒ 10–30%಑㥯႘౯ አಯ⌔ಮ Trypsin/Lys-C Mixಃಋ ഋ೙ഔಊ಑አಯ⌔ಭ౯ ⒥ᣱ౺ధሥ႞಑⑇፥ ጙ➙౯ᐢ࿂౼ಮ ⑇፥ೖഔ೸ഌ 㧂⍂ᵐኖ⑝ ೿ೇ೚ᵐኖ⑝ Missed K 18.6% 6.6% Missed R 3.6% 1.1% ೩ഋ೸೘ഔ಑አἝ✁⣓ᮎ ೩ഋ೸೘ഔಊ ྐྵᾬ⑇፥ Trypsin/Lys-C Mixಊ ྐྵᾬ⑇፥ Missed K (አಯ⌔ಭ಑ 80–90% ವᎢತಮ) Missed R Missed R Missed K NNNNNK NNNNNR NNNNNN Trypsin/Lys-C಑አἝ✁⣓ᮎ NNNNNK NNNNNR NNNNNN ⑇፥ೖഔ೸ഌ 㧂⍂ᵐኖ⑝ ೿ೇ೚ᵐኖ⑝ Missed K 2.6% 2.9% Missed R 4% 1.5% 11788MC Time (minutes) Time (minutes) 20 40 60 80 100 120 0 50 100 150 200 250 300 Peak Intensity (mAU) Peak Intensity (mAU) Specific tryptic cleavages Nonspecific, chymotryptic-like cleavages 20 40 60 80 100 120 0 50 100 150 200 250 300 Specific tryptic cleavages A. B. 17513MA Trypsin Platinum は、 マススペクトロメトリーや RP-HPLC-UV を用いた正確なタンパク質解析のために開発されたリコンビナ ントのトリプシンです。 検出可能なレベルの非特異的な消化活性は認められず、 また新しい化学修飾法により最大限の自己 消化耐性を有します。 タンパク消化効率が高く、 リコンビナントであるため動物由来のタンパクを含みません。 特長 • 非特異的消化の低減 • 極めて高い自己消化耐性 • 高純度精製品 • 優れた消化効率 • リコンビナント品による高いロット一貫性 • 動物由来成分不含 Trypsin/Lys-C Mix は Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade と rLys-C, Mass Spec Grade の混合物であり、 トリプシン単 独で消化するよりも消化効率を向上させ、 MS によるペプチド同定率を向上させます。 トリプシンは Arg と Lys のカルボキシル側、 Lys-C は Lys のカルボキシル側のエステル結合を加水分解する活性を持ちます。 トリプシン単独ではタンパク質が完全に消化されない場合が多く、切断部位の10～30％がミスドクリベージとして残りますが、 Lys-C を組み合わせることで全体的な分解効率 ・ 再現性が向上します。 標準的なプロトコールに加え、 難分解性タンパク質 の場合は 6-8M 尿素存在下での変性と消化を行う 2 ステップ法があります。 トリプシン単独と Trypsin/Lys-C Mix での切れ残り部位の比較　 消化は標準的なプロトコールに従って実施した。 Trypsin Platinum の特異性 Trypsin Platinum と Panitumumab (Vectibix®, Amgen 社) を 1:10の比率で消化し、生じたペプチドをRP-HPLC-UVで分析した。ペプチドのピー クを LC-MS で解析し、 特異的な切断を受けたペプチドと非特異的な切断を受けたペ プチドを区別した結果、 既製品の MS グレードのトリプシンには顕著な非特異的タンパ ク質分解活性があることがわかった （パネル A）。 詳細な分析により、 キモトリプシン 様の非特異的切断パターンが生じていることが示された。 対照的に Trypsin Platinum は特異的なトリプシン切断断片のみを生成した （パネル B）。 Trypsin Platinum, Mass Spectrometry Spec Grade ペプチドマッピングに理想的！ 最も正確で再現性のある新トリプシン Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade ダブルの力で切れ残り激減 トリプシンとトリプシン消化キット 4 ೠഔೲ೐㜠ೖഔ೸ഌವᐊ━፥ Rapid Trypsin ಡಂಒ Rapid Trypsin/Lys-C Mix ವ⒖ጆ LC-MS/MS 㕨⁷ᢗἩ 70rCಊ60ኟ㯒 ೅ഔ೎ആ೺ഝ೩ ‘≡㧄ಊᏬ᭚ᅥ⋳ Rapid Digest Buffer ವ⒖ጆ 13959MA ⑇፥౺ಂ೻೸ೢ೪಑㕨⁷䈲LC-MSಡಂಒUV HPLC䈳 A. 㤳ለ⁖ၡ࿃ಊ಑⑇፥ ᜤᮎ౭ಫಖTCEPಎಫಮ㤳ለ 37ބధ0.5 ᾌ㯒 IAMኖೃഌ೎ഌ፥ 37ބధ0.5 ᾌ㯒 AccuMAP™ Low pH Resistant rLys-Cಊ ೸഍⑇፥ 37ބధ1 ᾌ㯒 AccuMAP™ Modified Trypsin ಋ AccuMAP™ Low pH Resistant rLys-Cధ ಡಂಒAccuMAP™ Low pH Resistant rLys-C ᎜✺ಊ⑇፥ 37ބధ3 ᾌ㯒 B. 㳩㤳ለ⁖ၡ࿃ಊ಑⑇፥ AccuMAP™ Low pH Resistant rLys-Cಊ ೸഍⑇፥ 37ބధ1 ᾌ㯒 AccuMAP™ Modified Trypsin ಋ AccuMAP™ Low pH Resistant rLys-Cధ ಡಂಒAccuMAP™ Low pH Resistant rLys-C ᎜✺ಊ⑇፥ 37ބధ3 ᾌ㯒 ᜤᮎᏩಖ NEMಎಫಮ㤃㲜೘೚೧೅ഔ⌔ᙾ಑೷എ೤೐ 37ބధ0.5 ᾌ㯒 Rapid Digestion Trypsin, Rapid Digestion Trypsin/Lys-C AccuMAP® Low pH Protein Digestion Kit 酵素の修飾とバッファーの最適化により、 一般的に 4 ～ 18 時間のインキュベートを行っていたトリプシン消化 （またはトリプ シン / Lys-C 消化） を、 70 度での処理を可能としたことで 60 分に短縮できます。 ほとんどのタンパク質では還元やアルキ ル化は必要なく、 処理ステップを大幅に省略できるため多検体分析のサンプル調製や短時間で分析結果を求める方の前処 理に最適です。 還元、 アルキル化後や変性状態でも使用可能です。 一般的にペプチドマッピングのサンプル調製で用いるトリプシンやプロテアーゼはアルカリ性で効率の良いタンパク質消化が 可能です。 しかしアルカリ性での処理は脱アミド化などの人為的な非酵素的翻訳後修飾を引き起こすことが知られており、 解 析を困難にします。 本製品はすべての処理ステップを低 pH 条件下で行い、 消化効率は維持しながら質量分析用サンプル 調製で生じる人為的修飾を抑制します。 タンパク質の修飾状態を詳細に分析する抗体医薬品やタンパク製剤など、 品質管 理分析のサンプル調製に最適です。 Rapid Digestion Kit のワークフロー 特長 • トリプシン処理時間を劇的に短縮 • 変性剤が不要のためオフラインのサンプルクリーン アップも不要、 サンプルロスの機会も減少 • 還元剤、 アルキル化剤存在下で使用可能 • サンプルボリュームの制限がなく、 自由に実験系の設 計が可能 • ヒートブロックの他に特別な機器を必要とせず、 オート メーション化も可能 高速トリプシン消化キット トリプシン処理中に起こる人為的修飾を防ぐ 特長 • 低 pH で消化するため、 サンプル調製時に生じる脱ア ミド化、 ジスルフィド結合スクランブリング、 酸化を抑 制 • rLys-C は変性条件下でも活性があり、 リジンサイトで の切断効率を最大化 • メリットを活かせる標準的なシーケンスカバレッジ • トリプシン消化条件を最適化することで、 過消化による ベースラインノイズを最小化 • 還元条件、 非還元条件、 変性剤存在下 （グアニジン 塩酸塩、 尿素など） で使用可能 AccuMAP® Low pH Protein Digestion Kit のサンプル調製概要 トリプシンとトリプシン消化キット NEW 5 製品名 切断部位 特長 容量 カタログ番号 特異性の高いプロテアーゼ rLys-C, Mass Spec Grade Lys-C 8M urea のような変性条件に耐性があり、 プロテアーゼに 抵抗性のあるタンパク質の消化に使用。 リコンビナントで ネイティブタイプより安価。 15 µg V1671 Lys-C, Mass Spec Grade ネイティブタイプの Lys-C 20 µg VA1170 Arg-C Ultra, Mass Spec Grade Arg-C 極めて高い特異性。 プロリンに隣接するアルギニン （ArgPro 配列） にも対応。 6M urea 存在下および pH 5 〜 9 の範囲で高い活性。 5 µg VA1831 20 µg VA1832 Arg-C, Sequencing Grade Arg-C、 Lys-C ヒストン修飾の解析などに。 活性には DTT、 システインな どの還元剤と CaCl2 が必要。 10 µg V1881 Asp-N, Sequencing Grade Asp-N、 Cys-N ネイティブタイプの Asp-N。 urea （3.5M まで）、 guanidine HCl （1M）、 SDS （0.028% ま で ）、 ProteaseMAX™ Surfactant （0.026％まで ）、 acetonitrile （60％まで ）、 EDTA （2mM まで）、 DTT またはβ -mercaptoethanol 存 在下で 100% 活性残存。 2 µg V1621 rAsp-N, Mass Spec Grade Asp-N、 Cys-N リコンビナントでネイティブタイプより安価。 超純水で溶解 後 4℃で 8 週間は保存可能。 治療用モノクローナル抗体 など精製タンパク質のペプチドマッピングに好適。 10 µg VA1160 Glu-C, Sequencing Grade Glu-C、 Asp-C シークエンスカバー率向上のためトリプシン以外の選択肢 として使用 （In gel 消化には推奨しません）。 5 x 10 µg V1651 ProAlanase, Mass Spec Grade Pro-C、 Ala-C 至適 p H 1.5 （1 ～ 5.5）、 短い消化時間 （1 ～ 2 時間）。 酸性条件下での処理は人為的な非酵素的翻訳後修飾を 防ぐ。 5 µg VA2161 15 µg VA2171 rChymoSelect™ MS Grade Protease Kit Tyr、 Phe、 Trp の C 末端 高い切断特異性。 自己消化に対して高い耐性を持ち、 安 定性を維持するためにカルシウムを必要とせず、 リコンビ ナントタイプのためトリプシンの混入もない。 トリプトファン 残基の後で切断しない。 25 µg CS333204 100 µg CS333205 特異性の低いプロテアーゼ Chymotrypsin, Sequencing Grade 芳香族アミノ酸 (Tyr、 Phe、 Trp) の C 末端 膜タンパク質など疎水性タンパク質の消化などに。 urea （1M まで） または guanidine HCl （1M まで） 存在下で 80% 活性残存、 ProteaseMAX™ Surfactant （0.025% まで） では活性低下が見られない。 25 µg V1061 4 x 25 µg V1062 非特異的なプロテアーゼ Elastase Ala-C、 Val-C、 Ser-C、 Gly-C、 Leu-C、 Ile-C を優先的に切断 シークエンスカバー率向上のためトリプシン以外の選択肢 として使用。 5 mg V1891 Pepsin Phe-C、 Leu-C, Tyr-C、 Trp-C を優先的に切断 タンパク質の構造研究 （水素重水素交換質量分析など）、 抗体の解析に。 プロテアーゼに抵抗性のあるタンパク質 の消化に使用。 250 mg V1959 抗体消化用プロテアーゼ IdeS IgG ヒンジ部直下 ヒト （IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)、 サル、 ヒツジ、 ウサギ、 ヒ ト化抗体、 キメラ IgG 抗体、 Fc 融合タンパク質を消化。 30 分で消化完了、 特異性 ・ 再現性が高く、 原則 100% 完全消化。 除去を容易にするためヒスチジンタグを含む。 5000 u V7511 5 x 5000 u V7515 IdeZ IdeS からさらにマウス IgG2a および IgG3 サブクラスに対 する活性が飛躍的に向上。 30 分で消化完了、 特異性 ・ 再現性が高く、 原則 100% 完全消化。 除去を容易にす るためヒスチジンタグを含む。 5000 u V8341 5 x 5000 u V8345 プロテアーゼ消化促進剤 ProteaseMAX™ Surfactant, Trypsin Enhancer ー タンパク質を可溶化し、 分解効率およびゲル内消化後の ペプチド回収率が向上。 1 時間で消化完了。 1 mg V2071 5 x 1 mg V2072 NEW その他プロテアーゼと消化促進剤 8 ページ 7 ページ 6 ページ 6 ページ 8 ページ その他プロテアーゼと消化促進剤 www.promega.co.jp/promega_resources/selection/protein/ ProteaseMAX™ Surfactant はトリプシン以外の酵素にも使用できます。 各種プロテアーゼとの適合性はホームページをご覧ください。 6 0 20 40 60 Site of C-terminal Cleavage Cleavage Frequency (%) A C D E F G H I K L M N P Q R S T V W Y 17270MA アプリケーションセミナー （US HUPO 2021 より） ProAlanase を用いた上記アプリケーションに関する ユーザー様の発表をご覧いただけます。 酸性条件下で消化を行うメリット • 中性や塩基性の条件下で生じる脱アミド化やジスル フィド結合のスクランブル化など、 サンプル調製に起因 するアーティファクトを抑制 • 強酸性 pH （1.5 など） が変性剤として作用し、 タンパ ク質のアンフォールディングを促進 • 重水素の逆交換が制限されるため、 水素 – 重水素交 換 （HDX） 質量分析に使用可能 用途 • パレオプロテオミクス • ヒストンなどトリプシンでは消化に偏りが生じるサンプル の解析 • de-novo シーケンシング • リン酸化プロファイリングなどの翻訳後修飾解析 • ジスルフィド結合マッピング ProAlanase はプロリンやアラニン残基 C 末端側を優先的に切断するエンドプロテアーゼです。 真菌 (Aspergillus niger) から 分離 ・ 精製され、 An-PEP や EndoPro とも呼ばれています。 ボトムアッププロテオミクスで使用されるプロテアーゼの多くが 中性から弱アルカリ性の pH でタンパク質を切断するのに対し、 ProAlanase は酸性の pH （～ 1.0 – 5.5） で活性を示します。 消化時間は 1 ～ 2 時間です。 従来型の Arg-C （クロストリペイン） は、 アルギニンだけでなくリジン残基も切断し、 Arg-Pro 結合を切断できないため、 消 化が不完全になることがあります。 これに対し、 Arg-C Ultra は厳密なアルギニン特異性を持ち、 Arg-Pro 部位でも効率的に 加水分解できるように設計された酵素です。Arg-C Ultraは、リジン活性が検出されず、広い pH範囲で高い触媒効率を維持し、 高濃度尿素条件下でも活性を保ちます。 これにより、 ペプチドマッピング用途において一貫した消化性能を提供します。 ProAlanase の C 末端切断特異性　ヒト K562 抽出液を、 酵素 ： 基質を 1 ： 100 の割合で用い、 pH1.5 で 37℃で 2 時間、 ProAlanase で消化し た。 ペプチドは Q-Exactive Plus を用いた LC-MS/MS で分析した。 データは Byonic™ ソフトウェアを用い酵素を指定せずに検索した。 主にプロリンと アラニンの C 末端側で切断された。 Arg-C Ultra, Mass Spec Grade 迅速かつ極めて高い特異性と消化効率 ProAlanase, Mass Spec Grade 酸性条件でプロリン / アラニンの C 末端を切断 19142MA Trypsin Arg-C Arg-C Ultra A E G I L N Q S V Y 0 20 40 60 80 100 Percent Cleavage Frequency C D F H K M P R T W 特長 • アルギニン残基の C 末端でのみ切断 • 最適な消化条件下での未切断残基の最小化 • 30 分〜 2 時間で完了する迅速な消化反応 • Lys-C やトリプシンとの併用によるトリプシン様ペプチド の生成 • 6M 尿素存在下および pH 5 〜 9 の範囲での高い活性 • 幅広い酵素 ： 基質比に対応し、 サンプル量や条件に応 じたコスト効率を実現 Arg-C Ultra は、 従来の Arg-C およびトリプシンプロテアーゼと比較して、優れた切断特異性と消化効率を示す　ヒト K562 細胞抽出物を 1:50 の酵素 ： 基質比で、 37 ° C で一晩消化した。 得られたペプチドは、 Orbitrap Exploris™ 240 （Thermo Fisher Scientific） を用いた LC-MS/MS により分析した。 データ解析は、酵素指定なしの条件で Byonic ソフトウェア （Protein Metrics） を用いて実施した。 その他プロテアーゼと消化促進剤 参考文献 Ryzhaya P, et al. (2025) Arg-C Ultra Simplifies Histone Preparation for LC-MS/MS. Anal Chem. 97, 24, 12486-12492. 参考文献 Samodova, D. et al. (2020) ProAlanase is an effective alternative to trypsin for proteomics applications and disulfide bond mapping. Mol Cell Proteomics 19(12), 2139–56. 10 20 30 40 50 60 70 10 20 30 40 50 60 70 250 200 100 50 0 150 250 200 100 50 0 150 Semi- and non-specific peptides Many non-specific cleavages and short peptides are generated. Simplified chromatographic profile with increased peak intensity for specific peptides. Absorbance (UV 210nm) Time (minutes) A. Traditional Chymotrypsin rChymoSelect™ MS Grade Protease Kit Residue at Cleavage Site % Total MS Signal1.0 x 1010 8.0 x 109 6.0 x 109 4.0 x 109 2.0 x 109 W Y F L M H A C D E G I KNPQ R S T V – 0 B. Traditional Chymotrypsin Cleavages Residue at Cleavage Site % Total MS Signal 2.5 x 1010 2.0 x 1010 1.5 x 1010 1.0 x 1010 5.0 x 109 W Y F L M H A C D E G I KNPQ R S T V – 0 rChymoSelect™ Cleavages 7 rChymoSelect™ は、 抗体やその他のバイオ医薬品タンパク質のペプチドマッピングを改善するために開発された組換えキモトリプシンです。 従来のキモトリプシンは、 小さくかつ非特異的に切断されたペプチドを多数生成してしまうのに対し、rChymoSelect™ はチロシン、 フェニルアラニン、 ロイシン残基に対して劇的に改善された切断特異性を示します。 さらに、自己消化に対しても高い耐性を持っています。 これらの特性により、 従来のキモトリプシンに比べて、 よりシンプルで解析しやすいペプチドマップを得ることができます。 rChymoSelect™, MS Grade Protease Kit キモトリプシンの常識を変える高特異性 rChymoSelect™ MS Grade Protease Kit 従来型キモトリプシン （ウシ由来） 由来 Pichia pastoris ( リコンビナント ) ウシ膵臓 （動物由来） 切断特異性 Tyr, Phe, Leu, (Met*) Tyr, Phe, Trp ＋非特異的部位 Trp での切断 なし あり 自己消化 なし ** 高い カルシウム 依存性 なし あり トリプシン混入 なし 起こり得る ロット間再現性 高い 中程度 MS 適合性 クリーンなペプチドマップ に最適化済み ばらつきあり ペプチド品質が低い傾向 あり rChymoSelect™ と従来型キモトリプシンとの主な違い 特長 • チロシン（Tyr）、フェニルアラニン（Phe）、ロイシン（Leu） に対する高い切断特異性 • 非特異的切断の排除 • トリプシンの混入なし • 自己消化に対する高い耐性によるクリアなペプチド マップ • ロット間での一貫したパフォーマンス • 安定性維持にカルシウムを必要としない • ペプチドマッピングワークフロー向けに設計 ・ 最適化さ れた酵素 * タンパク質に依存　** 推奨される消化条件下での結果 rChymoSelect™ MS Grade Protease Kit は、 非特異的切断を低減し、 ペプチド解析の精度を向上させる パネル A. モデル基質を用いた従来のキモトリプシンと rChymoSelect™ MS Grade Protease Kit による消化の UV クロマトグラムを比較した従来のキモトリプシンでは、 多数のセミ特異的および非特異的な切断産物 （青矢印） を含む複雑なペプチド混合物が生成された。 これに対し、 rChymoSelect™ MS Grade Protease Kit は特異的切断によるピーク強度が増加し、 単純化されたペプチドプロファイルを示した。 パネル B. 質量分析に基づく切断特異性の定量結果を示す。 従来のキモトリプシンは複数の意図しない部位で切断を行ったのに対し、rChymoSelect™ MS Grade Protease Kit はフェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、ロイシン （L） に対して高い忠実性を示し、 トリプトファン （W） での切断を回避した。 従来型キモトリプシン 多数の非特異的切断が生じ、 短いペプチドが多く生成される。 従来型キモトリプシンによる切断 rChymoSelect™ MS Grade Protease Kit 特定ペプチドのピーク強度が向上し、 クロマトグラフィープロファイルが簡潔化される。 rChymoSelect™ による切断 その他プロテアーゼと消化促進剤 8 IdeS および IdeZ プロテアーゼはイムノグロブリン G (IgG) をヒンジ領域下部の 1 か所を特異的に切断し、 F(ab’)2 と Fc 断片を生じます。 どちらもヒト IgG1、 IgG2、 IgG3 および IgG4、 サル、 ヒツジ、 ウサギ、 ヒト化および キメラ IgG 、 Fc- 融合タンパク質を効率的に切断します。 また、 IdeZ プロテアーゼのみマウスの IgG2a および IgG3 を切断できます。 用途 • Fc 融合タンパク質や抗体薬物複合体 (ADC） など、 抗体医薬の特性解析 • F(ab’)2、 Fc 断片の生成 • 高い特異性を要する切断 特長 • 迅速かつ簡便 ： 最適化なしでも 30 分で消化完了 • 非常に特異性が高く、 抗体を一貫して F(ab’ ) ₂ フラグ メントおよび Fc フラグメントへ切断 • His タグが付加されているため反応液中から除去が可 能 • 幅広い生物種に使用可能な高い汎用性 • 優れたコストパフォーマンス IdeS Protease, IdeZ Protease 最適化不要、 30 分以内に IgG を切断 IdeS or IdeZ IgG (150kDa) Fc (50kDa) F(ab′)2 (100kDa) IgG1 Hinge sequence: S-C-D-K-T-H-T-C-P-P-C-P-A-P-E-L-L-G-G-P-S-V IdeS or IdeZ cleavage site IdeS および IdeZ プロテアーゼの切断特異性 IdeS プロテアーゼはStreptococcus pyogenes 由来の改変組換えプロテアーゼであり、 IgG のヒンジ領域の下の 単一サイトを切断し、 F(ab’)2 と Fc 断片を生じる。 IdeZ プロテアーゼは Streptococcus equi subspecies zooepidemicus 由来の改変組換えプロテアーゼであり、IdeS と同様に IgG のヒンジ領域の下部を切断し、 F(ab’)2 と Fc 断片を生じる。 IdeZ プロテアーゼはマウス IgG2a および IgG3サブクラスに対する活性が IdeS プロテアーゼよりも著しく改良されている。 12336TB IdeS IgG (150kDa) DTT LC (25kDa) Fc/2 (25kDa) F(ab′) 2 (100kDa) Fd′ (25kDa) Fc/2 + Glycans LC Fd′ Fc/2 + Glycans LC Fd′ A. B. C. Denature Fc (50kDa) Time IdeS および IdeZ プロテアーゼの切断特異性 IdeS による消化後、 還元および変性処理を行うことで、 HPLC による分離性が向上し、 質量分 析に理想的なフラグメントが得らる。 パネル A ： IgG を IdeS で消化後、 還元処理することで、 約 25 kDa の 3 種類のフラグメントが生成される。 パネル B：HPLC により分離された IdeS 消化産物の一例を示す。 パネル C： IdeS 消化により得られた 3 種類のフラグメントの質量分析結果を示す。 LC-MS による治療用抗体の特性解析 IgG を IdeS プロテアーゼで消化した後に還元処理を行うことで、約 25 kDa の 3 つのフラグメント（Fd’、Fc/2、LC）が生成され、 LC/MS による特性解析に最適です。 これらの小さなフラグメントにより高精度な質量測定が可能となり、 翻訳後修飾 （PTM） の検出を可能にします。 12336TB IdeS IgG (150kDa) DTT LC (25kDa) Fc/2 (25kDa) F(ab′) 2 (100kDa) Fd′ (25kDa) Fc/2 + Glycans LC Fd′ Fc/2 + Glycans LC Fd′ A. B. C. Denature Fc (50kDa) Time その他プロテアーゼと消化促進剤 9 O N H SO3 Na − + O O OH O H3 N SO3 + − Cleavable Bonds ProteaseMAX™ Surfactant (M.W. 425.51Da) Acid or temperature Hydrophobic Tail (M.W. 238.37 Da) Zwitterionic Head (M.W. 139.17 Da) + 8144TA Percent Intensity 100 90 70 80 60 50 40 30 20 10 0 2.2 × 104 699.0 1361.8 2024.6 2687.4 3350.2 4013.0 Mass (m/z) 9.1 × 103 Percent Intensity 100 90 70 80 60 50 40 30 20 10 0 699.0 1361.8 2024.6 2687.4 3350.2 4013.0 Mass (m/z) 8144TA Percent Intensity 100 90 70 80 60 50 40 30 20 10 0 2.2 × 104 699.0 1361.8 2024.6 2687.4 3350.2 4013.0 Mass (m/z) 9.1 × 103 Percent Intensity 100 90 70 80 60 50 40 30 20 10 0 699.0 1361.8 2024.6 2687.4 3350.2 4013.0 Mass (m/z) ProteaseMAX™ Surfactant は膜タンパク質の様なタンパク質であっても可溶化し、 トリプシン、 Lys-C やキモトリプシンなど のプロテアーゼによる分解効率を向上させます。 また、 タンパク質のゲル内消化では、 消化時間の短縮とペプチドの回収率 が改善されます。 本試薬は消化反応中に分解されるため除去処理は不要であり、分解物は質量分析や液体クロマトグラフィー に影響を与えません。 特長 • タンパク質を変性し、 プロテアーゼによる消化時間を 3 時間にまで短縮 • ゲルからのペプチド回収率が増加し、 タンパク質同定 精度が向上 • 室温で 1 時間以内に疎水性タンパク質を可溶化 • Urea と同時に使用して可溶性を向上 • 消化後に加熱や酸などによる不活性化処理が不要、 そのまま質量分析に使用可能 ゲルから 切り出し ProteaseMAX™ 存在下で トリプシン処理 1 時間 トリプシン処理一晩 消化液 （ペプチドが含まれる） を回収、 TFA を添加しトリプシンを不活性化し質量分析へ TFA でペプチド抽出 15 分 ACN/TFA でさらに 15 分 抽出液を合わせ、 Speed Vac で乾燥 1-2 時間 ペプチドをバッファーに 再溶解し質量分析へ ProteaseMAX™ Surfactant と従来法の作業フローの比較 ProteaseMAX™ Surfactant の物理的特性　陰イオン界面活性剤である ProteaseMAX™ Surfactant は 1 % ストック溶液であれば -20℃で安定で ある一方、 消化条件下 （例 ： 50℃で 1 時間、 ProteaseMAX™ Surfactant 濃度 0.025 %） で分解し、 界面活性剤様の特性を失う。 ProteaseMAX™ Surfactant を用いた効果的な In-gel タンパク質消化 （MALDI-TOF 解析）　タンパク質の In-gel 消化において ProteaseMAX™ Surfactant を使用した場合と未使用の場合の MALDI-TOF マススペクトルを示す。 マウス心臓から抽出した膜タンパク質を 4 – 20 % SDS-PAGE に供し、Coomassie® R-250 で染色した。 56 kDa の位置にあるバンドを切り出し、タンパク質を ProteaseMAX™ Surfactant 有り、 または無しの条件で消化した。 パネル A. 従来の一晩消化の後、 TFA / acetonitrile でペプチドを抽出した。 パネル B. ProteaseMAX™ Surfactant を用いて 1 時間消化した。 どちらの場合でも得られたペプチドは 10 µl C18 ZipTip® pipette tips (Millipore 社 ) で精製し、 OptiBeam™ on-axis laser 搭載 4800 MALDI-TOF/TOF Mass spectrometer (Applied Biosystems) で解析した。 バンド内の主要なタンパク質は H+ トランスポーターミ トコンドリア F1 複合体由来 ATP 合成酵素のβサブユニットとして同定された（アサインされたペプチドをアスタリスクで示す）。 シーケンスカバレッジ、 MASCOT スコア、 ランダムマッチの確率は従来法においてそれぞれ 50 %、 828、 1 x 10-76 であったのに対し、 ProteaseMAX™ Surfactant を用 いた場合は 75 %、 920、 3.2 x 10-87 であった。 ProteaseMAX™ Surfactant を用いると長いペプチド （2,300 – 4,000 Da） が効率的に回収された。 A. B. ProteaseMAX™ Surfactant, Trypsin Enhancer タンパク質の溶解性を高めて消化効率 ・ 再現性を向上 その他プロテアーゼと消化促進剤 参考文献 Saveliev SV, et al. (2013) Mass Spectrometry Compatible Surfactant for Optimized In-Gel Protein Digestion. Anal Chem. 85, 2, 907-914. NEW 製品名 特長 容量 カタログ番号 サンプル調整キット Magnetic Proteomics Sample Prep (MPSP) Kit SP3 法に基づく磁気ビーズを含むキットで、 サンプ ルのクリーンアップおよび濃縮が可能 100 回反応分 CS3325A04 タンパク質 MS Compatible Yeast Protein Extract, Digest 酵母タンパク質、 酵素処理済みタイプ 100 µg （凍結乾燥品） V7461 MS Compatible Human Protein Extract, Digest ヒトタンパク質、 酵素処理済みタイプ 100 µg （凍結乾燥品） V6951 MS Compatible Yeast Protein Extract, Intact 酵母タンパク質、 酵素未消化タイプ 1 mg （溶液タイプ *） V7341 MS Compatible Human Protein Extract, Intact ヒトタンパク質、 酵素未消化タイプ 1 mg （溶液タイプ *） V6941 ペプチドミックス 6×5 LC-MS/MS Peptide Reference Mix LC-MS のダイナミックレンジ ・ 感度評価用ペプチ ドミックスで、 フリーソフトウェアにより手計算不要 50 µl** V7491 200 pmol*** V7495 10 ** 溶液タイプ、 500 fmol のインジェクション 50 回分に相当 *** 凍結乾燥品、 5 pmol のインジェクション 40 回分に相当 * 溶媒組成 ： 6.5M Urea/50 mM Tris-HCl (pH 8) 濃度 ： 10 mg/ml サンプル調製 ・ リファレンス試薬 Magnetic Proteomics Sample Prep (MPSP) Kit 本製品には Single-Pot, Solid-Phase–enhanced Sample Preparation （SP3） 法に基づく磁気ビーズを含まれ、 ボトムアッププロテオミクスワークフローにおいて、 効率的かつ信頼性の高いタンパク質サンプルの前処理が可能です。界面活性剤や変性剤を含むバッファーを含め、 さまざまな条件に高い互換性を示します。 自動化に対応しスケーラブルであるため、 沈殿法、 FASP、 S-Trap といった従来法に代わる合理的な選択肢として、 手動および自動プラットフォームの双方に適しています。 SP3 磁気ビーズでタンパク質サンプル調製を簡素化 特長 • 多様な界面活性剤、 塩、 変性剤に対応 • 高い磁気応答性で容易なハンドリングとクリーンな分離 を実現 • 0.5 ～ 2 mg のインプット量に対応し、 手動および自動 ワークフローにシームレスに適合 • オンビーズ消化可能、 作業時間とサンプルロスを最小 化 • サンプル間およびラン間で信頼性の高い結果を提供 サンプル調製 ・ リファレンス試薬 MPSP Kit のワークフロー MS-Compatible Human Protein Extract Digest (V6951) 他社 HeLa protein Digest Standard 非酵素的翻訳後修飾 脱アミド化ペプチドスペクトル ≦ 12 % Not tested 酸化ペプチドスペクトル ≦ 5 % ＜ 10 % カルバミル化ペプチドスペクトル ≦ 5 % ＜ 10 % 切断ミス 切断ミス ≦ 10 % ＜ 10 % ペプチドクオリティ サンプル中のアミノ酸を定量 A280 タンパク質の断片化 1 % 以下 Not tested マッチングスペクトル ＞ 65% Not tested ロット間安定性 総タンパク質 ＞ 1,805 ー ユニークペプチド ＞ 12,463 LC-MS クロマトグラム がリファレンスに一致 1,194 のヒトのコアペプチドの 85% 以上同定 リファレンスとの ペプチドエリアの比 =0.75 ～ 1.125 10 個のリファレンスタンパク質の相対存在 量をモニターすることにより再現性を定量 Not tested 11 6 x 5 LC-MS/MS Peptide Reference Mix 本製品は同じペプチド配列のアイソトポローグ 5 種類× 6セットからなる 30 種のペプチドの混合物であり、 液体クロマトグラフィー （LC） と質量分析装置 （MS） のパフォーマンスのモニタリング、 手法の開発や最適化などに使用できます。 アイソトポローグは配列中に組み込まれた安定重同位体標識アミノ酸の数のみが異なります。 標識は ¹³C と¹⁵N 原子からなります。 各アイソトポローグはクロマトグラフィーで分離できませんが、 質量が異なるため質量分析装置では明瞭に分離されます。 各ペプチドのアイソトポローグは 10 倍段階希釈されています。 これらの特長により機器のダイナミックレンジや感度の評価が 1 回のランで可能となります。 LC-MS 性能評価用ペプチドミックス Mass Spec-Compatible Protein Extracts LC-MS 性能評価用タンパク質消化物＆抽出物 質量分析装置のパフォーマンスチェックやサンプル調製の最適化、 手法開発を行うための酵母 （Saccharomycescerevisiae） ならびにヒト （K562 細胞株） のタンパク質抽出物です。 酵母抽出液は比較的コンパクトでよく研究されたプロテオームを研究する方に、ヒト抽出液は広いダイナミックレンジを有する複雑なプロテオームの研究に適しています。抽出液は、液体クロマトグラフィー / 質量分析 (LC-MS) にすぐ使用できるようトリプシン処理後固相抽出したものと、 質量分析用のサンプル調製を最適化するためのテストマテリアルに使用できるトリプシン未消化タイプがあります。 特長 • 細胞培養条件から製造工程におよぶ厳重な管理により 一貫性のあるタンパク質構成を保証 • 抽出液のロット間の安定性は、 LC-MS およびアミノ酸 分析を含む様々なタンパク質 / ペプチド定量 / 定性分 析によりモニタリング • 非特異的断片化や非生物学的な翻訳後修飾および最 小限の未消化ペプチドのモニタリングにより、 LC-MS との適合性を確認 • 安定したペプチド保持時間、 シグナル強度、 その他重 要なパフォーマンスパラメーター 品質管理項目の比較 サンプル調製 ・ リファレンス試薬 496.7 499.7 502.2 504.7 509.3 496.7 499.7 502.2 504.7 509.3 414.7 417.7 420.7 424.2 428.2 553.8 556.8 559.8 562.8 566.8 447.3 450.3 453.3 456.3 459.8 521.8 525.3 528.8 532.3 537.3 518.3 521.8 525.3 530.3 535.3 414.7 417.7 420.7 424.2 428.2 553.8 556.8 559.8 562.8 566.8 447.3 450.3 453.3 456.3 459.8 521.8 525.3 528.8 532.3 537.3 518.3 521.8 525.3 530.3 535.3 Hydrophobicity 496.7(m/z) 499.7(m/z) 502.2(m/z) 504.7(m/z) 509.3(m/z) VTSGSTSTSR 414.7(m/z) 417.7(m/z) 420.7(m/z) 424.2(m/z) 428.2(m/z) LASVSVSR 553.8(m/z) 556.8(m/z) 559.8(m/z) 562.8(m/z) 566.8(m/z) YVYVADVAAK 447.3(m/z) 450.3(m/z) 453.3(m/z) 456.3(m/z) 459.8(m/z) VVGGLVALR 521.8(m/z) 525.3(m/z) 528.8(m/z) 532.3(m/z) 537.3(m/z) LLSLGAGEFK 518.3(m/z) 521.8(m/z) 525.3(m/z) 530.3(m/z) 535.3(m/z) LGFTDLFSK 1X 0.1X 0.01X 0.0001X 0.001X Time (minutes) Total Ion Intensity (TIC) Log (intensity) Log (peak height) (mass/charge) Log (mole) Peptide Concentration 6 × 5 LC-MS/MS Peptide Reference Mix の標準的なワークフローおよ び対応する特長 6 種類のペプチドセットからなる混合物は、 合計 30 種類 のペプチドで構成されている。 各ペプチドセットは、 安定同位体で重標識さ れたアミノ酸を配列中に組み込むことにより質量のみが異なる、 5 種類のア イソトポログの混合物である。 保存条件 Digest タイプは -20℃保存、 0.1% TFA またはギ酸で溶解後は 4℃で 3 週間、 -20℃または -70℃で 6 ヶ月まで保存可能。 複 数回の凍結融解を避けるため、 溶解後に小分けにし、 ドライアイ スで瞬間凍結して冷凍保存することが望ましい。 Intact タイプは -70℃保存。 複数回の凍結融解を避ける。 11003MA Endo HはN結合型複合型グリカンを切断しない 高マンノース型 構造 ハイブリッド型 構造 複合型グリカン 構造 a1,6 a1,3 b1,4 b1,4 a1,6 a1,3 b1,4 b1,4 a1,6 a1,3 b1,4 b1,4 N,N′-ジアセチルキトビオース コア構造 Endo H 切断部位 PNGase F 切断部位 GlcNAc マンノース ガラクトース シアル酸 Asn Asn Asn 製品名 切断部位 特長 容量 カタログ番号 N 結合型糖鎖除去 PNGase F N- 結合型糖鎖の最も内 側の N- アセチルグルコ サミンとアスパラギン残 基間 ほとんどの N- 結合型糖鎖をタンパク質から切断。 リコンビナント で低コスト、 ProteaseMAX™ と併用も可能。 2 時間で反応完了。 500 u V4831 Endoglycosidase H ジアセチルキトビオース コア内 N- アセチルグル コサミン残基間 N- 結合型糖鎖のうち、 高マンノース型糖鎖、 ハイブリッド型糖鎖 をタンパク質から切断。 10,000 u V4871 50,000 u V4875 コントロール基質 Fetuin ー O 結合型および N 結合型の糖鎖付加部位を持つ、 グリコシダー ゼ用コントロール基質。 500 µg V4961 グリコシダーゼ PNGase F • Elizabethkingia miricola よりクローニングされ、 大腸 菌で発現させた組換えグリコシダーゼで、 分子量は 36 kDa • N 結合型糖タンパク質から高マンノース、 ハイブリッド 型オリゴ糖、 複合型オリゴ糖の最も内側の GlucNAc 残 基とアスパラギン残基間の切断を触媒 Endoglycosidase H （Endo H） • Streptomyces plicatus 由来のグリコシダーゼで、 大 腸菌で発現させた組換え型酵素 • 高マンノース型構造のキトビオースコアあるいは N 結合 型糖タンパク質からハイブリッドオリゴ糖を切断 • ジアセチルキトビオースコア内の 2 つの N- アセチルグ ルコサミン残基間を切断し、 アスパラギン上に 1 個の N- アセチルグルコサミン残基を残す PNGase F と Endo H の切断部位 グリコシダーゼ ユニット定義 1 ユニットは、 トータルボリューム 10 μ l の反応系で 37℃、 1 時 間で 10 μ g の変性 RNase B から 95% 以上の糖を除去するため に必要な酵素量です。