血清・バルク乳からのウイルスRNA抽出 ～微量なBVDウイルスを効率的に検出～

血清・バルク乳からのウイルスRNA抽出 ～微量なBVDウイルスを効率的に検出～ ここがMaxwell 導入のポイント！ • バルク乳の場合、RT-PCRの電気泳動の結果、スピンカラムの核酸精製キットに比べ、スメアなバックグラウンドが減少し、明確な判別が可能であること。 • 血清の場合、溶血した血清でも判別可能であり、精製能力が非常に高いこと。 • 検査会社では、限られた時間内での多検体処理が求められるが、安定した品質での処理が可能であり、装置への信頼性が高いこと。 • 簡単なオペレーションで作業を自動化できるため、ヒューマンエラーによるリスクを軽減でき、作業効率や労働生産性が向上すること。 • キットやメソッドが充実しており、前処理方法の異なる多種多様なサンプル（バルク乳、血清、スワブ、耳片）にも対応できる高い汎用性を有すること。 牛ウイルス性下痢・粘膜病の清浄化を図るためには、① PI 牛の早期摘発　②ウイルスの侵入防止　（導入牛の着地検査）③感染予防（ワクチン、一般衛生管理など）が重要である。PI 牛の摘発法として、搾乳牛ではバルク乳を用いた定期的なスクリーニング、乾乳牛、育成牛、妊娠牛、新生子牛および導入牛については、血清、耳片、スワブなどを用いた遺伝子検査が有用である。これらの遺伝子検査は、PI 牛の早期発見のみならず、農場におけるBVD ウイルスの浸潤状況を把握するためにも、私たちは広く推奨したい。 血清・バルク乳からのウイルスRNA 抽出 〜微量なBVD ウィルスを効率に検出〜 日本動物特殊診断株式会社 岩野 直美 先生 蛯沢 雅司 先生 Maxwell® RSC の達人に教わる困難サンプルの鉄板プロトコール Pro K（ ＋） Pro K（ －） 図-1　 Pro k 処理による溶出液への ビーズ持ち込み量の違い Pro k 処理により溶出液への ビーズ持ち込みが大幅に減少 ラボプロトコール 体細胞ペレットの作成 • 50 ml 遠沈管にバルク乳を入れ遠心（3,500 rpm、10 分） • 上清を捨て、同作業を繰り返す →バルク乳100 ml 分の体細胞を回収 RNA 抽出 • ステップ 3 から全量をMaxwell® RSC カートリッジ（カタログ番号 AS1340）に加え、Maxwell® RSC での核酸自動抽出を実施 • 50 ～ 100 μl のNuclease-Free water にて溶出 判定 • RNA 抽出液を用いて、RT-PCR を実施 • 抽出および逆転写反応を確認するため、BVDV およびハウスキー ピング遺伝子を検出し、判定を行う Pro K 処理 • 体細胞破砕液を遠心（15,000 rpm、3 分） • 上清400 μl を新しいチューブへ移し、Proteianse K Solution 50 μL を加え、室温で15 分以上反応 2 体細胞ペレットの破砕 • 体細胞ペレットにビーズ、1-Thioglycerol/Homogenization Solution （TH Solution）およびLysis buffer を200 μl ずつ入れ組織破砕機にて破砕 （血清の場合：血清200 μl にTH Solution、Lysis buffer 各200 μl および Proteinase K Solution 50 μl を加え、室温で15 分以上 反応させて、ステップ4 に進む） • 乳汁は劣化が著しいため、素早い処理が重要である。 • サンプルの粘性が高いため、Proteianse K Solution 処理を行うことで溶出液へのビーズ持ち込みを抑えることができる（右上写真）。 • RNA を選択的に抽出するため、 DNase I 処理が重要である。 バルク乳から効率よくRNA を抽出するためのポイント 図-2　 Maxwell® とスピンカラムにおける判定確度の差 レーン No. 1 2 3 4 サンプル（血清） A B A B 判定（シグナル） +++ +++ ± + Maxwell® で回収したウイルスtotal RNA では、カラムで回収したRNA よりも明瞭なバン ドが検出された。 Maxwell® スピンカラム 図-3　 溶血した血清での判定確度が高いMaxwell® 回収 RNA レーン No. 1 2 3 サンプル（血清） A （溶血あり） B （陰性） C （溶血なし） 判定（シグナル） +++ – +++ 溶血の有無（No.1、3）に影響されることなく明瞭なバンドが検出された。 Maxwell® プロメガ株式会社 TEL：03-3669-7981 E-mail : prometec@jp.promega.com Web : www.promega.jp