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Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Assay

Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter (NanoDLR™) Assay は1つのサンプルよりホタルおよびNanoLuc® ルシフェラーゼの活性を連続的に測定することができます。改良されたホタル側のアッセイケミストリと明るく高感度なNanoLuc® ルシフェラーゼにより、従来よりも高感度で、質の高いデーターが得られ、使いやすさやアッセイデザインの柔軟性も向上しています。


従来のデュアルルシフェラーゼアッセイから移行するなら今がチャンス!

NanoGlo® Dual-Luciferase スタートアップキャンペーン

新しい試薬を試したいけど、ベクターを買ったり、作ったりするのが面倒!測定機器が無い!
やり方が分からない!そんな方にも全面サポートいたします。

  • パフォーマンスの向上
  • より高感度に!
  • マルチアッセイ
  • 使いやすさ

NanoDLR™ Assay はより明るく、安定

Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter AssayではまずONE-Glo™ EX Luciferase Assay Reagentでホタルのルシフェラーゼ活性を測定します。 つぎにNanoDLR™ Stop & Glo® Reagent を加えることによりホタルのシグナルを消光させ(クエンチング)、同時にNanoLuc® ルシフェラーゼ活性測定ための基質を供給します。発光シグナルの半減期はどちらのレポーターも2時間以上です。

 
NanoDLR™ アッセイのより明るく安定な発光特性

TK-Rluc(ウミシイタケ):TK-Fluc(ホタル):キャリア DNA または TK-Nluc( NanoLuc®):TK-Fluc:キャリア DNA をそれぞれ 1:1:8 の割合で HEK293 細胞にトランスフェクションし、NanoDLR™、DLR™ または Dual-Glo® Dual-Luciferase Assay System を用いて測定した。同じプロモーターでルシフェラーゼを発現させた場合、NanoDLR™ Assay により測定した Nluc レポーターで最も明るい長時間発光シグナルが得られ、Fluc レポーターも十分明るい長時間発光シグナルが得られた。

消光作用の向上と優れた感度

ホタルルシフェラーゼ(Fluc)の強力な阻害により優れたシグナルの分離が可能となました。高いFluc活性を測定した後に、NanoLuc® ルシフェラーゼ(Nluc)の発現が少ない場合でも正確な測定が可能です。

 
クエンチング効率の改善

NanoDLR™ Stop & Glo® Reagent は、感度を損なうことなく、ホタルルシフェラーゼのシグナルをバックグラウンドレベル(100万分の1)にまで低下させるため、2つのレポーターのシグナルを効果的に分離するとともに第2レポーターの測定値が安定します。

Dual-Glo® や DLR™ Assayにおけるウミシイタケに比べ
NanoLuc® ルシフェラーゼはより高感度

より明るくなったNanoLuc® シグナルとホタルルシフェラーゼシグナルの消光作用が改良されより高い感度とシグナル/バックグラウンド比が達成されました。この優れた消光作用(クエンチング)とNanoLuc® ルシフェラーゼの高い生物発光レベルが組み合わさり、レポーターアッセイの感度を最大限に引き上げました。

 
Nanoluc® ルシフェラーゼの感度

精製したウミシイタケまたはNanoLuc® ルシフェラーゼのタイトレーションによる発光を高濃度の精製ホタルルシフェラーゼ存在下(100nM)または非存在下で比較した。感度はバックグラウンド発光値の2倍のシグナルに必要な酵素量として決定した(ダッシュの線)。ホタルルシフェラーゼ非存在下では長時間発光タイプのNanoLuc® のシグナルはDLR™ Assay のフラッシュタイプのウミシイタケの発光よりも数倍高感度。ホタルルシフェラーゼシグナルが高い場合でもNanoDLR™ Assayは約10倍の感度を示す。NanoDLR™ Assayはホタルルシフェラーゼ非存在下 Dual-Glo™ Assay よりも300倍以上の感度を示し、ホタルシフェラーゼ存在下でも3000倍以上高感度。

ホタルまたはNanoLuc® ルシフェラーゼは
どちらか1方を実験レポーターにできますが、
両方を実験レポーターとして使用することも可能です!

Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter (NanoDLR™) Assayはご自身のアッセイデザインに合わせて様々なベクターの組み合わせが利用できます。

  • - NanoLuc® ルシフェラーゼ を実験用レポーターとして
  • -ホタルルシフェラーゼを実験レポーターとして
  • -タンデム(コインシデンス )レポーターシステム

実験レポーターとしてのNanoLuc® ルシフェラーゼ

最も明るく、最も応答性の高いフォーマット
こんなケースに:細胞数が少ない場合、初代培養細胞などトランスフェクション効率が低くレポーター実験が困難であった細胞での使用
コンストラクト: NlucP (実験用)+ Fluc (内部標準用)

NanoLuc® ルシフェラーゼを実験レポーターにした場合

NFkB-NanoLuc® PEST ベクターと TK-Fluc コントロールを 比率10:1 でHEK293細胞にトランスフェクションした。 TNFαで処理し、4時間後に NanoDLR™ assay でレポーター活性を測定した

実験レポーターとしてのホタル ルシフェラーゼ

既存の実験用ホタルルシフェラーゼレポーターベクターをそのまま使用可能。
NanoLuc® の使用により信頼性の高い内部標準値が得られる
こんなケースに:標準的なレポーターアッセイフォーマット。
NanoLuc® はウミシイタケよりも最大1000倍明るいため、内部標準用レポーター DNA 量を飛躍的に低減可能(これまで内部標準でお困りの方)
コンストラクト:FlucP(実験用)+ Nluc(内部標準用)

NanoLuc® ルシフェラーゼを内部補正用レポーターにした場合

NFkB- Fluc-PESTベクターと TK-Nanoluc®コントロールを 比率10:1 でHEK293細胞にトランスフェクションした。 TNFαで処理し、4時間後に NanoDLR™ assay でレポーター活性を測定した。

実験レポーターとしてのホタル ルシフェラーゼ

2つの異なるシグナル応答を同時に測定可能
こんなケースに:一度に2 つのシグナル経路をより高感度に測定。タンパク質安定性とレポーターアッセイのマルチプレックス。
コンストラクト: Nluc P(実験用)+  FlucP(実験用)またはFlucP(実験用) + Nluc(タンパク質安定性検出用)

同一サンプルでのタンパク質ダイナミクスと遺伝子発現の測定

HEK293 細胞に pNLF1-HIF1A [CMV/neo] 融合タンパク質発現コンストラクトと低酸素応答エレメントを含む pGL4.42 [luc2P/HRE/Hygro] を1:1000 の割合でトランジェントにトランスフェクションした。18 時間後に様々な濃度の1,10-フェナントロリンで刺激し、ホタルルシフェラーゼ転写レポーターとHif1a-NanoLuc® 融合タンパク質を Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter(NanoDLR™)Assay で表示の時点で定量した。

タンデム(コインシデンス )レポーターシステム

1つのORFから2つのレポーターを発現
こんなケースに:標的遺伝子の発現に真に影響する化合物と偽陽性ヒットとの区別。
コンストラクト:Firefly-P2A-NanoLuc®-PEST

試薬安定性の向上により繰り返しの使用が簡便になり無駄も減少

NanoDLR™ Assayの構成品を再溶解した ONE-Glo™ EX Reagent の室温あるいは7℃での安定性が向上し、後日使用する場合の分注保存や冷凍保存の手間が低減されます。

再溶解したThe NanoDLR™ Reagent の安定性の向上

再溶解した各試薬を22°Cまたは7°Cで保存し、一定時間–70°Cで凍結した。溶かした各試薬と精製したホタルまたはNanoLuc® ルシフェラーゼを混和し、3分後に各サンプルから得られた発光シグナル強度から相対活性を算出した(22°Cでインキュベーションをせずに– 70°C保存したサンプルのシグナル強度に対する相対値)。n=3。

スループットに合わせた様々なフォーマットに適合

Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Assayの発光シグナル安定性の向上で、より簡便な"添加 – 混和 –測定 "プロトコールが実現しました。試薬はインジェクションベースのプロトコルだけでなくpassive lysis bufferによる細胞溶解液調製によるプロトコルにも対応します。
ホモジニアスアッセイフォーマット:培地中の細胞を用いた直接的なアッセイ。両レポーターの半減期が2時間なので複数のプレートでのバッチ処理もサポートします。
インジェクションベースアッセイフォーマット:デュアルインジェクターあるいは試薬ディスペンサーを組み合わせたGloMax® Discover などのルミノメーターを用いた細胞への試薬分注。