HOME > 日本オリジナル情報 > チャレンジ2020キャンペーン 細胞での検証編

チャレンジ2020キャンペーン 細胞での検証編

チャレンジ2020 細胞での検証編


NGSなどの網羅的解析結果より ターゲットが決まったら細胞で検証!
培養細胞を用いた解析により、網羅的解析から得られた仮説に対する“答え合わせ” が可能です!
さらに、詳細な分子メカニズムを探るためにも、細胞実験は有用です。

発現解析

タンパク質発現・分解 検出

HiBiT は11アミノ酸という短い発光ペプチドタグで、LgBiTおよびフリマジン(F)を供給することでホタルの約30倍の発光シグナルを生じます。

これまでに無い極小のタグなので、ベクターでの導入はもとよりCRISPRゲノム編集により内在遺伝子ローカスにHiBiTをノックインして、タグの影響を最小限に抑えたタンパク質の発現、分解を高感度に検出することができます。検出用の抗体が無い、入手困難な場合にも有用です。

4つの検出法
  • ● 細胞溶解検出法(細胞溶解剤を含む試薬を使用。細胞内外のタンパク質を検出。)
  • ● 細胞外タンパク質検出法  (非細胞透過性試薬を使用。膜タンパク質・分泌タンパク質を検出。)
  • ● ブロッティング検出法  (ブロッティング用の試薬を使用。メンブレンに転写されたタンパク質を検出。)
  • ● 生細胞での細胞内タンパク質検出法(細胞透過性試薬およびLgBiT安定発現細胞を使用)
アプリケーション NanoLuc ツールボックス
やってみよう!HiBiTノックイン実験 ここではゲノム編集の基礎から、具体的にHiBiTをゲノム編集(CRISPR/Cas9)でノックインする実験の手順、有効性について解説します。

シグナル伝達解析

タンパク質:タンパク質相互作用 (PPI)アッセイ

親和性の低い NanoLuc® サブユニット LgBiTとSmBiT を相互作用について調べたいタンパク質XおよびYに付加し、細胞内で発現させることで、タンパク質間の結合性を発光量として高感度に測定することができます。 これらのアッセイは、マルチウェルプレートフォーマットで、内在性発現レベルでのタンパク質相互作用の検出を可能にします。さらに、NanoLuc® 酵素と蛍光標識可能なHaloTag® によるBRETを利用したアッセイもご利用いただけます。

アプリケーション NanoLuc ツールボックス
  • ● 細胞内でのタンパク質:タンパク質相互作用 [ F、❷、❽
発光を利用したリアルタイム細胞内タンパク質相互作用(PPI)アッセイ in vitroでのタンパク質間相互作用は必ずしも生体内でのそれを反映しているとは言えません。そのため実用的な細胞内での解析法が望まれてきましたが、従来法はシグナルの低さやライセンスなどの問題で使いにくい場面もありました。ここでは、NanoLucをベースとした酵素断片相補アッセイ法のNanoBiT® およびNanoLucを用いたBRET法であるNanoBRET™ の基礎から応用例までをご紹介します。

Lumit™ イムノアッセイテクノロジー

Lumit™ Immunoassayは、LgBiTまたはSmBiTで標識した1次抗体または2次抗体を用いて標的タンパク質(リン酸化など修飾タンパク質なども)を検出する、ホモジニアスなプレートベースの発光イムノアッセイです。ELISAやウエスタンブロッティングなど従来のイムノアッセイ法とは異なり、洗浄やブロッティングが不要なので、シンプルで迅速(わずか30分)なアッセイが可能です。

アプリケーション NanoLuc ツールボックス
  • ● 細胞ライセート中の標的タンパク質の爆速イムノアッセイ[ F、❺、❾
NanoLuc® Binaly Technologyのイムノアッセイへの応用 このセミナーでは 本技術の概要、特性、利点について解説するとともにDIYキットにおける抗体の選び方や標識操作におけるコツなどについてご説明いたします。

転写制御解析

レポーター遺伝子アッセイ

レポーター遺伝子アッセイは、プロモーターなどの転写制御配列の機能解析法として汎用されてきました。また、既知の応答配列を利用することにより様々な生物活性の敏感な測定法としても利用されています。NanoLucルシフェラーゼは従来使用されてきたホタルルシフェラーゼの100倍の発光シグナルを生じるため、微弱な応答性を検出でき、導入するレポーターベクター量を抑えることもできるため、より生体に近いアッセイを行うことができます。

アプリケーション NanoLuc ツールボックス
  • ● 転写制御領域の機能解析 [ F、❶
レポーターアッセイの基礎「失敗しないレポーターアッセイ」を構築しよう レポーター遺伝子アッセイは、細胞を用いたアッセイ系であるために非細胞系に比較し多くのステップを必要とします。このセミナーでは、レポーターアッセイの基礎として、ベクターの選択、基質の選択等々、アッセイの構築法および代表的なアプリケーションを紹介します。

ターゲット:化合物相互作用

NanoBRET™ ターゲットエンゲージメント アッセイ

NanoLuc® 酵素と蛍光標識されたテスト化合物の結合を、エネルギー伝達技術(BRET)を利用して生細胞内で測定する方法です。本アッセイは、化合物-標的タンパク質が結合する滞留時間に関する情報も提供し、阻害剤パネルをスクリーニングしてIC50値を比較するためにも使用することができます。

アプリケーション NanoLuc ツールボックス
  • ● 細胞内での標的タンパク質と化合物との結合性を測定 [ F、❷、❻
キナーゼ研究分野での発光アッセイの応用 ~酵素活性、化合物バインディング、リン酸化解析 生化学的解析によって細胞内における化合物の効果を評価することは困難であり、生細胞で化合物評価が可能なアッセイが待望されていました。このニーズに対しプロメガでは、生細胞内で化合物と標的キナーゼの結合を評価できるアッセイシステムを開発しました。
Powered by Formstack