【組織用】ReliaPrep™ RNA Miniprep System 簡易日本語プロトコル

ReliaPrep™ RNA Miniprep System INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCTS Z6014, Z6015 Quick PROTOCOL Revised 2026/05 【組織用プロトコール】 キット構成品のうち1-Thioglycerolは開封後2～10℃、その他は15~30℃で保管してください。 RNA精製を行う際には、手袋やマスクを着用するなど、RNaseの混入を避けるように注意してください。 試薬の調製 ◎RNA Wash Solution(RWA)、Column Wash Solution(CWE)の調製 RWAおよびCWEのボトルに95%エタノールを下表のとおり、添加します。 ＊添加後は蓋をしっかりと締めて、15～30℃で保管してください。 ◎Lysis Buffer(LBA)+TG Bufferの調製 LBAのボトルに1-Thioglycerol(TG)を下表のとおり、添加します。 ＊添加後は蓋をしっかりと締めて保管してください。2～10℃で、調製後30日間保管が可能です。 ＊使用計画に応じて、使い切れる量を調製してください。 ◎DNase Iの調製 DNase I(凍結乾燥) のチューブ1本あたり275μlのNuclease-Free Water(キット付属) を加え、穏やかに撹拌して溶解します。溶解する際に、ボルテックスはしないでください。 ＊溶解したDNase I溶液は、使用量に応じて分注して、-20℃で保管してください。3回を超える凍結融解は避けてください。 プロトコールの概要 試薬 RNA Wash Solution Column Wash Solution Z6014 Z6015 Z6014 Z6015 構成品ボトル 35ml 206ml 5ml 24ml 95%エタノール 60ml 350ml 7.5ml 36ml 試薬 Z6014 Z6015 LBA 30ml 150ml 1-Thioglycerol 600μl 3000μl ReliaPrep™ RNA Miniprep System INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCTS Z6014, Z6015 Quick PROTOCOL 技術的なお問合せは： e-mail: prometec@jp.promega.com・Tel: 03-3669-7980 詳細なプロトコールは、英文マニュアル #TM774 をご覧ください。 Revised 2026/05 非線維性組織用プロトコール サンプルタイプ： 肝臓、腎臓、脳、脂肪組織など 1. LBAに1-Thioglycerol(TG)を添加したことを確認し、下表の通りにLBA+TG Bufferを加えます。 注意：カラムにアプライできる最大ライセート量は500μlまでです。これより多いとRNA収量が低下します。 2. 組織サンプルをホモジナイザーで破砕したのち、ゲノムDNAのせん断のため、P200またはP1000で7～10回のピペッティングを行います。 3. 作製したホモジネートを14,000 x gで3分間遠心し、クリアライセートを新しいチューブに移します。作製したライセートは、-70℃で保存することが可能です。 4. 下表にしたがって、サンプルに100%イソプロパノールを添加し、5秒間ボルテックスします。 注意：凍結保存したライセートを使用する場合には、氷上または2～10℃で融解し、十分に混和して均一化してからご使用ください。 5.ミニカラムをCollection Tubeにセットし、サンプルを加えて室温(20～25℃)で遠心します(12,000～14,000 x g, 1分間)。 6. Collection Tubeに貯まった液(フロースルー)を捨て、再度ミニカラムをCollection Tubeにセットします。500μlのRNA Wash Solution (エタノール添加済み)をミニカラムに加えて遠心します(12,000～14,000 x g, 30秒間)。フロースルーを廃棄します。 7. DNase I Incubation mixを調製します。ボルテックスを避けて穏やかに混合してください。表中には1サンプルあたりの試薬量を示しています。サンプル数に応じて試薬量を計算して、混合・調製してください。 8. 30μl のDNase I Incubation mixをミニカラムに添加して、室温で15分間インキュベートします。 9. 200μlのColumn Wash Solution(エタノール添加済み)をミニカラムに加えて遠心します(12,000～14,000 x g, 15秒間)。 10. 500μlのRNA Wash Solution(エタノール添加済み)をミニカラムに加えて遠心します(12,000～14,000 x g, 30秒間)。 組織重量 LBA + TG Buffer添加量 0.25mg ～ 5mg 250μl 5mg ～ 20mg 500μl 組織重量 100%イソプロパノール添加量 0.25mg ～ 5mg 85μl 5mg ～ 20mg 170μl 試薬 Volume ｘ サンプル数 ＝ 合計 Yellow Core Buffer 24μl MnCl2, 0.09M 3μl DNase I 3μl ReliaPrep™ RNA Miniprep System INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCTS Z6014, Z6015 Quick PROTOCOL 技術的なお問合せは： e-mail: prometec@jp.promega.com・Tel: 03-3669-7980 詳細なプロトコールは、英文マニュアル #TM774 をご覧ください。 Revised 2026/05 11. ミニカラムを新しいCollection Tubeに移し替えて、300μlのRNA Wash Solution(エタノール添加済み)を加えて遠心します (12,000～14,000 x g, 2分間)。 12. ミニカラムをElution Tubeに移し替えます。下表を参考にして、溶出用のNuclease-Free Waterをミニカラムに加えて、遠心します(12,000～14,000 x g, 1分間)。Elution Tubeは蓋同士が当たらないように蓋を外側に向けます。 13. チューブのキャップを閉めて、-70℃で精製RNAを保管します。 組織重量 Nuclease-Free Water添加量 0.25mg ～ 5mg 15μl 5mg ～ 20mg 30μl ReliaPrep™ RNA Miniprep System INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCTS Z6014, Z6015 Quick PROTOCOL 技術的なお問合せは： e-mail: prometec@jp.promega.com・Tel: 03-3669-7980 詳細なプロトコールは、英文マニュアル #TM774 をご覧ください。 Revised 2026/05 線維性組織用プロトコール ※このプロトコールは非線維性組織には使用しないでください。 サンプルタイプ： 心臓、骨格筋、皮膚、食道、大動脈など 1. LBAに1-Thioglycerol(TG)を添加したことを確認し、下表の通りにLBA+TG Bufferを加えます。 注意：カラムにアプライできる最大ライセート量は500μlまでです。これより多いとRNA収量が低下します。 2. 組織サンプルをホモジナイザーで破砕したのち、ゲノムDNAのせん断のため、P200またはP1000で7～10回のピペッティングを行います。 3. LBA+TG Bufferと等量のRNA Dilution Buffer(RDB)を加え、10秒間ボルテックスし、室温で1分間インキュベートします。目に見える沈澱が形成されます。10,000 x gで3分間遠心し、クリアライセートを新しいチューブに移します。作製したライセートは、-70℃で保存することが可能です。 4. 下表にしたがって、サンプルに100%イソプロパノールを添加し、5秒間ボルテックスします。 注意：凍結保存したライセートを使用する場合には、氷上または2～10℃で融解し、十分に混和して均一化してからご使用ください。 5. ミニカラムをCollection Tubeにセットし、サンプルを加えて室温(20～25℃)で遠心します(12,000～14,000 x g, 1分間)。 注意：LBA+TG Bufferを500μl使用した場合、ライセートを2回に分けて(670μlずつ)遠心してください。 6. Collection Tubeに貯まった液(フロースルー)を捨て、再度ミニカラムをCollection Tubeにセットします。500μlのRNA Wash Solution (エタノール添加済み)をミニカラムに加えて遠心します(12,000～14,000 x g, 30秒間)。フロースルーを廃棄します。 7. DNase I Incubation mixを調製します。ボルテックスを避けて穏やかに混合してください。下表には1サンプルあたりの試薬量を示しています。サンプル数に応じて試薬量を計算して、混合・調製してください。 8. 30μlのDNase I Incubation mixをミニカラムに添加して、室温で15分間インキュベートします。 9. 200μlのColumn Wash Solution(エタノール添加済み)をミニカラムに加えて遠心します(12,000～14,000 x g, 15秒間)。 組織重量 LBA + TG Buffer添加量 0.25mg ～ 5mg 250μl 5mg ～ 20mg 500μl 組織重量 100%イソプロパノール添加量 0.25mg ～ 5mg 170μl 5mg ～ 20mg 340μl 試薬 Volume ｘ サンプル数 ＝ 合計 Yellow Core Buffer 24μl MnCl2, 0.09M 3μl DNase I 3μl ReliaPrep™ RNA Miniprep System INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCTS Z6014, Z6015 Quick PROTOCOL 技術的なお問合せは： e-mail: prometec@jp.promega.com・Tel: 03-3669-7980 詳細なプロトコールは、英文マニュアル #TM774 をご覧ください。 Revised 2026/05 10. 500μlのRNA Wash Solution(エタノール添加済み)をミニカラムに加えて遠心します(12,000～14,000 x g, 30秒間)。 11. ミニカラムを新しいCollection Tubeに移し替えて、300μlのRNA Wash Solution(エタノール添加済み)を加えて遠心します (12,000～14,000 x g, 2分間)。 12. ミニカラムをElution Tubeに移し替えます。下表を参考にして、溶出用のNuclease-Free Waterをミニカラムに加えて、遠心します(12,000～14,000 x g, 1分間)。Elution Tubeは蓋同士が当たらないように蓋を外側に向けます。 13. チューブのキャップを閉めて、-70℃で精製RNAを保管します。 組織重量 Nuclease-Free Water添加量 0.25mg ～ 5mg 15μl 5mg ～ 20mg 30μl 詳細なプロトコールは、英文マニュアル #TM774 をご覧ください。