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テックの一言コラム_2017年7月号 発光プレートリーダーでのプレートの 選択を考える

結果 考察 記載のプレートを用いて、200 µL、あるいは 40 µL 分注という条件で実施 している。したがって、容量を変更する、あるいはプレートの型番、メーカー、 さらには測定装置を変更することにより、結果は異なるものの、傾向は同 様と考えられる。 384 well 黒 plate では白シールと黒シールで cross-talk(%)に 2 倍程度の違 いとなっているが、カウントが低いため大きな差が認められなかったと考 えられる。 発光プレートリーダーでのプレートの 選択を考える[Vol. 14] 2017年7月号 プレート・シール:すべて Corning 社 96 ウエルクリアボトムプレート 白プレート;cat # 3917 クリアボトム白プレート;cat # 3610 黒プレート;cat # 3916 クリアボトム黒プレート;cat # 3603 384 ウエルクリアポトムプレート クリアボトム白プレート;cat # 3707 クリアボトム黒プレート;cat # 3712 プレートシール 白プレートシール;cat # 38446 黒プレートシール;cat # 38496 サンプル調製 96 ウエルプレート Bactiter™ Glo (Promega Cat. # G8231)の取り扱い説明書に従い、適当な濃 度の ATP 溶液に Bactiter™ Glo を等量混和し 1 well あたり 200 µL 分注。周 りのウエルには精製水を 200 µL 分注。 384 ウエルプレート Luciferase Assay System (Promega cat# E1500)の取り扱い説明書に従い、 適当な濃度の Beetle Luciferin(Promega cat# E1601)溶液に Luciferase Assay System を1:5の割合で混和し1 well あたり 25 µL 分注。 クリアボトムプレートは測定後、ボトムに白あるいは黒シールを貼り付けた 後に測定。 測定装置 GloMax Discover (Promega) 0.3sec/well 設定 データ処理 Sample を囲むウエルのクロストークを下記式に従い、算出。 テクニカルの ひと こと コラム 発光アッセイでマイクロプレートはどうすればよいか マルチプレートリーダーで利用できるプレートの種類は多種多様で、最適なものを選べる半面、測定の観点から、 望ましくないものを使ってしまう恐れもあります。弊社で扱っているキットは主にルシフェラーゼを利用した長時間発 光技術を用いています。本来ルシフェラーゼはフラッシュタイプのシグナルでしたが、長時間発光の基質の開発により、 扱いが便利になった反面、隣のウエルの光の漏れこみ、いわいるクロストークが起き、これをいかに押さえ込むかと いう点が問題になります。 今回は細胞を扱った実験で多く使われている底が透明なプレートについて考察をします。 クリアボトムのプレートを用いた場合、4種のクロストークが考えら得ます。(右 模式図) A ; プレートトップと PMT の距離(装置の構造、あるいは蓋をしたままの測定など) B;プレートの材質、色、厚さなど C ; クリアボトムプレートは多くの場合透明なポリスチレンの板であり、その中を走る光 D;プレートボトムを通して拡散した光 今回以下の測定を行いました。 結論 プレートを白から黒にすることにより、カウントは 1/10 ~ 1/20 に低下する。(ボトムがクリアか否かにかかわらず。) 96, 384 両フォーマットにおいて、クリアボトム白プレートに白シールを貼ると、カウントは 50 ~ 70% 増加するものの、クロストークは 5 倍程度増加した。一方、 黒シールを貼ると、カウントは最大 10% 程度減少するが、クロストークは 1/3 程度低減する。 96, 384 両フォーマットにおいて、クリアボトム黒プレートに白シールを貼ると、カウントは増加し、クロストークは最大 40 倍程度減少する。一方、黒シールを 貼ると、カウントは 10 ~ 20% 程度減少するが、クロストークは 1/20 ~ 1/200 に 低減した。 発光試験において顕微鏡観察のためクリアボトムのプレートを用いる際は、補正(カウント、クロス トーク)する目的と、用いるクリアープレートの色に応じて、シールの選択が考えられる。クロストー ク補正を優先する場合は、黒シールが第一選択と考えられる。 (blank 補正はしていません。) Crosstalk(%)= (a+b+c+d+e+f+g+h) 8 × 100 A count a d f b A g c e h format Plate color bottom color Corrected count(CPS)# Recovery(%) Crosstalk(%) 96 白 白 268,250,000 ー 0.0070 クリア 92,617,267 100 0.094 クリア / 白シール 161,029,913 174 0.40 クリア / 黒シール 89,699,356 97 0.033 黒 黒 10,474,142 ー 0.00044 クリア 9,773,454 100 0.074 クリア / 白シール 12,775,906 131 0.0020 クリア / 黒シール 10,163,200 104 0.00040 384 白 白 266,456,321 ー 0.34 クリア 106,943,776 100 0.18 クリア / 白シール 156,059,016 146 1.2 クリア / 黒シール 97,276,787 91 0.13 黒 黒 5,750,520 ー 0.0010 クリア 6,646,168 100 0.067 クリア / 白シール 7,716,353 116 0.061 クリア / 黒シール 6,350,681 96 0.0026 # corrected count:測定時間による発光の減衰等を補正した値。 白シール 黒シール カウント クロストーク カウント クロストーク クリアボトム白プレート クリアボトム黒プレート A B C D PMT plate bottomplate wall(white or black) テクニカルサービス Tel. 03-3669-7980/Fax. 03-3669-7982 E-Mail : prometec@jp.promega.com プロメガ株式会社 本   社 〒103-0011 東京都中央区日本橋大伝馬町14-15 マツモトビル Tel. 03-3669-7981/Fax. 03-3669-7982