HiBiT-Pulldown

HiBiT Pull-down Kit (CS1967B02) HiBiT融合タンパク質をLgBiT-HaloTagとHaloTag Beadsで補足することでプルダウンアッセイできるキットです。LgBiTに対してHiBiT よりも高親和性のDrkBiT peptideを用いて非変性条件で溶出することができます。またSDS-PAGEでの解析用にSDSローディングバッ ファーに直接溶出することもできます。＊正式マニュアルは製品ご購入時にご案内いたします。 A. プルダウン概要 B. キット構成 Part # Component Unit Volume Quantity CS1967B01 HaloTag®-LgBiT Protein 0.5 ml 1 CS3002A01 DrkBiT Peptide 0.1 ml 1 G7281 Magne® HaloTag® Beads 1 ml 1 C. 必要な試薬類 Lysis Buffer: Mammalian Lysis Buffer (Promega G9381) RQ1 RNase-Free DNase I (Promega M6101), diluted 100-fold into the buffer Protease Inhibitor Cocktail (Promega G6521), diluted 50-fold into the buffer Wash Buffer: Tris-buffered saline (TBS) + 0.05% (v/v) IGEPAL CA-630 (Sigma I3021) D. プロトコール 1. Lysis Bufferを用いてHiBiT融合タンパク質発現細胞を破砕する。 2. 15,000 rpm, 5 min遠心し、上清を新しいチューブに回収する。 3. HaloTag-LgBiTを、サンプル量あたり1/100倍量添加する（例 10 ul HaloTag-LgBiT/1 mlサンプル）。 4. 室温10分間インキュベーションする。 5. Magne HaloTag Beadsを添加する（Beads使用量 4–10 ul Beads/1 mlサンプル推奨）。 6. ローテーターを用いて室温1-3時間混和する。 7. 1 ml Wash Bufferを用いて、1-4回Beadsを洗浄する。 8. 溶出 A. DrkBit peptideによる溶出（非変性条件） i. HaloTag-LgBiT添加量の1/5倍量のDrkBiT peptideを含むElution bufferを調製する。 （例 HaloTag-LgBiT 10 ulの場合、2 ul DrkBiTをwash bufferに添加し、elution bufferとする） ii. Wash bufferを除いたBeadsにElution bufferを加え、室温30分間インキュベーションする。 iii. 上清を回収する。 B. SDSローディングバッファーによる溶出 i. Wash bufferを除いたBeadsにSDSローディングバッファーを加える。 ii. 70℃ 5-10分間加熱する。 iii. 上清を回収する。 データ例 HiBiT融合firefly luciferase発現するHEK293細胞からHiBiT Pull-down Kitを用いてプルダウンアッセイし、NanoGlo HiBiT Blotting System (Promega N2410)によりHiBiT融合firefly luciferaseを検出した。