pGEM®-T Vector Systems ・ pGEM®-T Easy Vector Systems

T-Vectorの総合的なクローニングの効率に影響するその他の要因は何ですか?

あるインサートのクローニングの効率を予測することは不可能です。その効率はインサートのサイズ、配列、PCR産物の精製度などの多くの要因に依存するためです。これらの要因はコンピテントセルの効率と並び、T-Vectorへのクローニングを成功させるために重要です。例えば、大きなサイズのインサートでは欠失や再構成が起こりやすいため、目的のインサートがクローニングされる効率は減少します(注意:プロメガのpGEM®-TおよびpGEM®-T Easy Vector Systemでは7.5kbまでのインサートのクローニングに成功しています)。クローニングされにくいインサートでは、一般的にDNAの再構成を最低限に抑えるためにデザインされた株を使うことが必要です。さらに、小さなインサートではlacZ geneのリーディングフレームを破壊できないために、コロニーが白色を呈しない可能性があります。このような場合、出現した青いコロニーの多くは目的のインサートを含んだリコンビナントのベクターである可能性があります。バックグラウンドの青いコロニーよりもサンプルの方でより多くの青いコロニーが現れている場合、このような事象が起こっていると考えられます。

ヌクレアーゼが混入していると、PCR産物の精製度はクローニングの効率に影響を与えます。ベクターの”T”の突出とPCR産物の”A”の突出が欠失した場合、平滑末端のライゲーションになるためクローニングの効率は著しく低下します。耐熱性DNA polymeraseが3’→5’ エキソヌクレアーゼ活性(プルーフリーディング活性;表1)を示す場合、ほとんどのPCR産物が平滑末端になります。下記の文献2において”A”の突出を付加するための簡単なA-tailingプロトコールを紹介しています。pGEMR-TまたはpGEMR-T Easy Vector Systemに添付される取り扱い説明書Technical Manual TM042にはクローニングの効率についての重要な知見が詳細に記載されています。(PN68-Q&A)

表1.耐熱性ポリメラーゼの比較(1)

特長Taq / AmpliTaq®TflStoffel FragmentTthVent® (exo-)Vent® / (Tli)Deep Vent™PfuPwoUlTma®
5'→3' ExoXXXXXXX
3'→5' ExoXXXXX
RTXNANANA
増幅DNA 末端3'A3'A3'A3'A70% 平滑  30% 1塩基突出>95% 平滑平滑平滑平滑>95% 平滑

参考文献:

  1. Newton, C.R. and Graham, A. (1994) PCR, BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford, UK.
  2. Promega Connections https://www.promegaconnections.com/a-quick-method-for-a-tailing-pcr-products/

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