RQ1-RNase_Free-DNase

RQ1 RNase-Free DNaseをどのように使ったら、RT-PCRに使うためのRNAサンプルから混入したゲノムDNAを取り除くことができるのですか。

40 mM Tris-HCl (pH 7.9)、10 mM NaCl、6 mM MgCl2、10 mM CaCl2を含むバッファー中で最も高い活性が得られます。RQ1 RNase-Free DNaseを使うと、RT-PCR(a)を実施する前に、トータルRNA、poly(A)+ RNAまたはin vitro転写産物から混入したゲノム(またはプラスミド)DNAを除くことができます。この酵素は、最大の活性を得るためにカルシウムやマグネシウム/マンガンを必要とし(1)、一般的に1μgのDNA(またはRNA)に対して、1ユニットのRQ1 RNase-Free DNaseが使われます。様々なバッファー(制限酵素、リガーゼ、RT(reverse transcriptase)、CIAP(calf intestinal alkaline phosphatase)中で切断を行えます。しかし、40mM Tris-HCl(pH 7.9)、10mM NaCl、6mM MgCl2、10mM CaCl2を含むバッファー中で最も高い活性が得られます。万が一のRNAの分解を防ぐためにRNasin® Ribonuclease Inhibitorを入れることもできます。37℃、15~30分間のインキュベーションの後、フェノール/クロロフォルム/イソアミルアルコール抽出とエタノール沈殿や、ReliaPrep™ RNA Clean-Up and Concentration System (カタログ番号 Z1071など)でRQ1 RNase-Free DNaseを除去します。さらに、RT-PCRで使用するプライマーは、テンプレートRNAとゲノムDNAからの生産物を区別できるようにイントロンをはさむようにデザインします。(PN68-FAQ)

参考文献:

1)Ausubel, F.M. et al. (1994) In: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, 3.12.

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